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目的： 检测分析结核分枝杆菌对14种常见抗结核药物的敏感性；分析微孔板刃天青显色法用于结核分枝杆菌环丝氨酸（D-Cycloserine，DCS）药物敏感性的检测并评价其检测效果；结合间隔区寡核苷酸基因分型（Spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping），探讨DCS耐药性与北京家族基因型菌株的关联性；探索结核分枝杆菌DCS耐药性与可能的靶酶alrA、ddlA和cycA基因突变的关系，为我国结核病的防治提供相关基础科学依据。 材料方法： 1.145株结核分枝杆菌临床分离株自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所（以下简称传染病所）菌株库中选取，分别来源于福建、广西、河南、湖南、四川、新疆和西藏等省级结核病防治所或结核病医院，由传染病所结核室进行菌种鉴定为结核分枝杆菌并进行药物敏感性试验。结核分枝杆菌标准菌株H37Rv也由传染病所提供。 2.用微孔板刃天青显色法（Resazurin microtiter assay，REMA）检测145株临床分离株对14种常见抗结核药物的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。采用固体罗氏培养基比例法确定所选结核分枝杆菌菌株DCS耐药表型；将菌株MIC数值通过log2对数转换后，用ROC曲线（Receiver operatingcharacteristiccurve）判断DCS药敏临界值。 3.对所选的临床分离株进行 Spoligotyping基因分型鉴定，从统计学角度分析北京基因型与DCS耐药表型是否存在关联性。 4.查阅文献筛选DCS最可能的相关靶基因alrA、ddlA和cycA，采用Primier5.0设计引物， PCR扩增、DNA直接测序法测定目的基因全长；用 Bioedit7.1.10进行实验菌株与标准菌株H37Rv的序列比对分析，了解相关基因的突变情况。 结果： 1.对氨基水杨酸、莫西沙星、左氧氟沙星、乙胺丁醇、链霉素 MIC50较低，利福喷汀、利福平、异烟肼和环丝氨酸的MIC50较高。对氨基水杨酸、妥布霉素和莫西沙星的MIC90较低，利福喷汀、异烟肼、环丝氨酸、链霉素和利福平的MIC90较高。结核分枝杆菌菌株对一二线抗结核药物的敏感性分布呈现出不同的特点。 2.比例法检测145株临床分离株的DCS药敏结果为24株耐药，121株为敏感株。采用REMA检测这些菌株的DCS药敏，比例法检测的耐药的菌株中，5株菌株的MIC为16μg/ml；12株菌株的MIC为32μg/ml；6株菌株的MIC为64μg/ml；1株菌株的MIC为128μg/ml；而比例法检测为敏感的菌株中，1株的MIC为1μg/ml；3株为2μg/ml；16株为4μg/ml；43株为8μg/ml；58株为16μg/ml。ROC曲线分析显示曲线下面积AUC为0.950，P值＜0.001。Youden指数 J=0.79。Medcale软件判定最佳临界值为16μg/ml。此时，以比例法检测结果做参照，微孔板刃天青显色法的灵敏度和特异度分别为79.17％和100%，诊断符合率为96.55%。 3. Spoligotyping基因分析对145株临床分离株Spoligotyping的杂交结果指纹图谱进行分析，与国际数据库SpolDB4.0进行比对。统计分析北京家族基因型为88株，占60.7%（88/145），包括86株经典型北京家族株，2株为非典型北京家族株。非北京家族菌株为57株，占比为39.3%（57/145）。非北京家族中，大部分为T家族，占非北京家族比例为35.1%（20/57），17株为新发现菌株基因型，占29.8%（17/57）。88株北京基因型家族中DCS耐药为18株，耐药率为20.5%(18/88)，57株非北京基因型家族中DCS耐药为6株，耐药率为10.5%(6/57)，两者耐药率差异无统计学意义(χ2=2.47, P＞0.05)。 4.DCS耐药菌株中alrA突变率为4.2%(1/24)，突变株261位AGC→AAC(Ser→Asn)，一株敏感株alrA基因337位GGT→GGC，为Gly同义突变。耐药菌株中未发现ddlA突变，仅一株敏感株92位CGT→CGC，为Arg同义突变。DCS耐药菌株中cycA突变率为12.50%（3/24），分别为188位CCT→GCT(Pro→Ala)、318位CGA→CTA(Arg→Leu)和508位GCA→TCA(Ala→Ser)。DCS敏感株中cycA存在2种同义突变，分别为521位CGT→CGC(Arg)和406位TCG→TCA(Ser)，其中406位突变有两株菌株。 结论： 1.首次采用微孔板刃天青显色法初步了解了结核分枝杆菌临床分离菌株对14种常用抗结核药物敏感性的MIC谱。 2.研究建立了检测结核分枝杆菌对环丝氨酸敏感性的微孔板刃天青显色法，并首次通过ROC曲线确定了结核分枝杆菌对环丝氨酸敏感性的阈值为16μg/ml，具有很好的应用效果，并且该法具有检测时间短、成本低的优点，推广应用的前景良好。 3.结合Spoligotyping分型结果，结核分枝杆菌北京基因型与菌株环丝氨酸耐药之间无明显的相关性。 4.准确的菌株鉴定和基因分型以及标准化的药敏试验对于科学指导结核病防治具有重要意义。 5. alrA和cycA基因的单核苷酸非同义突变可能是DCS耐药性增加的原因之一，但DCS耐药机制尚待更深入的研究。