肿瘤是医学界研究的焦点，人们一直为寻求有效的治疗手段达到抗肿瘤生长转移的目的而努力。随着分子生物学及基因工程的迅速发展，基因治疗以成为恶性肿瘤的有效治疗手段之一，在众多的基因治疗方法中，自杀基因疗法引起了许多学者的兴趣，是一种较为有效的方法，成为近年基因治疗的研究热点。该疗法除能直接杀伤转基因的肿瘤细胞外，还可利用其独特的“旁观者效应”杀伤周围大量未转基因的瘤细胞，另外还有先转染后治疗、可靶向作用、可诱导免疫等优点，在肿瘤的基因治疗中具有独特的优势。但目的基因转导率低、肿瘤细胞对相应的前药的抗药性及不同类型的肿瘤细胞对各种自杀基因治疗系统的敏感性不同等缺点严重影响了自杀基因治疗的效果。如何采取更有效的自杀基因系统是目前所急需解决的问题。 高效基因转移载体和合适的目的基因的选择是影响疗效的关键因素。腺病毒是高效的基因转移载体，它既能感染分裂旺盛的细胞也能感染静止期细胞，而且病毒滴度高、易于储存等，因而成为肿瘤基因治疗的主要载体之一。在in vivo基因转移途径中腺病毒载体则为病毒性载体中的首选，体内转移率可达70％-80％以上。传统的细胞内同源重组腺病毒载体制备方法步骤繁多、工作量大，而且成功率较低。已有学者利用细菌内同源重组法制备重组腺病毒，使制备过程大为简化、成功率高。而“两步同源重组法”是David ES等提出的一种在细菌内同源重组法的基础上进行改良的简便高效快捷的最新方法。 随着研究的深入，有学者发现不同类型的肿瘤对两种自杀基因治疗系统的敏感性不同，如胃肠道的肿瘤对CD／5-FC基因治疗系统较为敏感，而脑胶质瘤等对TK／GCV自杀基因治疗系统敏感。另外，在单用CD／5-FC或TK／GCV自杀基因治疗系统后复发的肿瘤细胞对相应的前药产生了耐药性。因此有学者联合应用en/5一FC系统和TK/GCV系统(double suicide gene)治疗肿瘤，发现可获得协同作用，大大提高了抗肿瘤效应，但未发现耐药性产生。 目前由于以肿瘤细胞为靶点的基因治疗的疗效不能令人满意，许多学者尝试以肿瘤血管为治疗靶点，通过抑制肿瘤新生血管生成，切断肿瘤供养来抑制肿瘤生长，减少肿瘤的浸润和转移，己取得了较为满意的效果，成为近年肿瘤生物治疗的研究热点。近年研究己表明肿瘤血管的生长速度是正常组织的50一100倍。肿瘤血管之所以能持续生长关键在于其血管内皮细胞的增殖能力，而肿瘤血管内皮细胞的增殖与多种内皮细胞生长因子有关，其中血管内皮生长因子(VEGF)是最重要的因子，是已知最强的促内皮细胞有丝分裂原，是血管形成的关键因子。VEGF促进肿瘤血管的生长必须与血管内皮细胞表面的vEGF受体(vEGFR)相结合，使vEGFR胞内部分磷酸化而激活，通过信号转导进一步激活基因表达、DNA和蛋白合成，从而产生细胞生长信号，促使血管内皮细胞分裂、增殖。肿瘤新生血管除了营养肿瘤细胞促使肿瘤生长外，还可以通过其建立的微循环促使肿瘤细胞转移。因此抑制肿瘤血管生成大大增强了抗肿瘤效果。现已知VEGFR有五型，其中n型受体 (KDR/Flk一l)与肿瘤的新生血管形成关系最为密切。研究表明VEGF与大肠癌的恶性程度和转移有关。我们的实验也表明大肠癌组织中KDR表达明显增加。 为了提高自杀基因的靶向性，近年来有学者利用肿瘤细胞特异的启动子来调控目的基因，从而使目的基因在特定的肿瘤组织中表达。目前较常用的有甲胎白蛋白(AFP)启动子介导自杀基因治疗肝癌，采用癌胚抗原(CEA)启动子介导自杀基因治疗大肠癌等，虽然治疗效果有了明显的提高，但不适用于AFP、cEA分泌较低的肿瘤。由于vEGF主要在肿瘤细胞及间质细胞产生，而VEGFR主要在肿瘤血管内皮细胞中表达，利用vEGF与VEGFR启动子可调控目的基因在肿瘤细胞与肿瘤血管内皮细胞中选择性表达，目前有学者己进行了这方面的初步研究。在上述基础上，本课题拟构建以KDR启动子调控下的cD一TK双自杀基因重组腺病毒，以腺病毒介导的双自杀基因选择性杀伤大肠癌血管内皮细胞，同时考虑与VEGF启动子介导双自杀基因联合应用，通过一方面VEGF启动子介导的双自杀基因选择性杀伤分泌VEGF的大肠癌细胞，减少VEGF的分泌;另一方面，KDR启动子介导双自杀基因选择性杀伤大肠癌血管内皮细胞，两者协同作用，双途径，多方位的治疗大肠癌。 目的 研究腺病毒介导的双自杀基因在KDR启动子调控下对血管内皮细胞的选择性杀伤作用，为进一步开展肿瘤血管的靶向治疗研究奠定基础。首先利用改进的AdEasy系统构建携带KDR启动子/C Mv启动子调控的双自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒。针对传统的细菌内同源重组法制备腺病毒过程仍较复杂，成功率低和对实验室条件要求高等缺点，通过先构建AdEasier一1细菌后进行细菌内同源重组的“两步转化法”来简化实验过程，缩短实验周期，提高成功率。构建好的腺病毒用于感染HuvEc细胞和Lovo细胞，测定感染效率，检测转基因的表达，对转基因细胞施以前药(5一FC和/或GCV)，观察转基因细胞对前药的敏感性，比较不同转基因细胞对前药的?