背景与目的职业性三氯乙烯药疹样皮炎（OMDT）是工人职业性暴露于三氯乙烯（TCE）后出现的一种以大面积皮肤、黏膜过敏反应为特征,并伴有多脏器损害的职业性皮肤病。临床上根据病变类型和严重程度将OMDT分为剥脱性皮炎、多形红斑、Stevens-Johnson综合征和表皮坏死松解症四种类型。虽然在TCE职业暴露人群中,OMDT的发生率只有0.25-12.5%,但OMDT起病急、进展快、病死率高,有超过9%的患者死于继发性感染、多脏器衰竭或肝性脑病。我国是OMDT的高发区,已报道的病例数超过了全球病例总数的95%。这使得OMDT成为我国皮肤病和职业病领域的重点、难点问题之一。临床研究显示,除了皮肤黏膜损伤外,OMDT患者还常伴有多脏器损伤,包括免疫性肾损伤。此外,本课题组构建模拟OMDT患者状态的TCE经皮肤致敏小鼠模型结果显示,TCE致敏能引起小鼠肾脏免疫性损伤,致敏阳性小鼠肾小管上皮细胞（TECs）存在大量补体膜攻击复合物（MAC）C5b-9的沉积,提示C5b-9在TCE致敏性肾损伤中的重要作用。但C5b-9引起TCE致敏小鼠肾损伤的确切机制还不清楚。本研究拟通过动物实验结合体外细胞实验探讨C5b-9沉积在TCE致敏引起的TECs损伤中的作用及其机制。方法动物实验:选用6-8周龄BALB/c雌鼠构建TCE经皮肤致敏小鼠模型。适应性喂养一周后剃除小鼠背部被毛、裸露背部皮肤。根据体重将小鼠“S”型分为空白对照（Blank）组、溶剂对照（Vehicle）组和TCE处理组。第1天,各组小鼠分别背部皮下注射100 μl生理盐水（NS）、100 μl溶剂（丙酮:橄榄油:FCA=3:2:5,v-v-v）和 100μl 25%TCE（TCE:丙酮:橄榄油:FCA=5:3:2:10,v-v-v-v）。第4、7、10天为致敏阶段,各组小鼠每天背部皮肤分别涂抹100 μl NS、100 μl溶剂（丙酮:橄榄油=3:2,v-v）和 100 μl 50%TCE（TCE:丙酮:橄榄油=5:3:2,v-v-v）。第17、19天为激发阶段,各组小鼠每天背部皮肤分别涂抹100 μl NS、100 μl溶剂（丙酮:橄榄油=3:2,v-v）和 100 μl 30%TCE（TCE:丙酮:橄榄油=3:5:2,v-v-v）。末次激发24h后根据皮肤是否出现红斑、水肿等过敏反应将TCE组小鼠分为TCE致敏阴性（TCE-）组和TCE致敏阳性（TCE+）组。第21天收集小鼠尿液、血清和肾脏组织。动物实验包括两部分。第一部分:用TCE联合铁死亡抑制剂（Fer-1）处理小鼠。根据TCE致敏模型加设TCE+Fer-1（Fer-1）组,在初次激发和末次激发前腹腔注射Fer-1（5 mg/kg）。根据处理和皮肤过敏反应将小鼠分为Blank、Vehicle、TCE-、TCE+、TCE+Fer-1 致敏阴性（Fer-1-）和 TCE+Fer-1 致敏阳性（Fer-1+）组,研究TECs铁死亡在TCE致敏性肾损伤中的作用。第二部分:用TCE联合补体调节蛋白CD59处理小鼠。根据TCE致敏模型加设TCE+CD59（CD59）组,在初次激发和末次激发前腹腔注射CD59（1.25 mg/kg）。根据处理和皮肤过敏反应将小鼠分为Blank、Vehicle、TCE-、TCE+、TCE+CD59致敏阴性（CD59-）和TCE+CD59致敏阳性（CD59+）组,探讨C5b-9在TCE致敏引起TECs铁死亡中的作用。细胞实验:用补体C5b6作为底物和来源于正常人血清（NHS）中的补体C7、C8和C9在人TECs（HK-2）膜上组装成C5b-9,探讨C5b-9在引起TECs铁死亡的机制。细胞实验包括五个部分。第一部分:用不同浓度C5b6（0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μg/ml）和10%NHS处理HK-2细胞,探讨C5b6最适处理浓度并建立C5b-9攻击HK-2细胞模型;第二部分,用C5b6和NHS联合1 μM铁死亡抑制剂Fer-1处理HK-2细胞,探讨C5b-9是否可以引起HK-2细胞铁死亡;第三部分:用C5b6和NHS联合IP3R小干扰RNA（siR）处理细胞,探讨C5b-9引起HK-2细胞细胞质Ca2+超载的原因;第四部分:用C5b6和NHS联合2 μM细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM处理细胞,探讨胞质Ca2+超载在C5b-9引起HK-2细胞线粒体紊乱和铁死亡中的作用;第五部分:用C5b6和NHS联合10 nM线粒体膜转运孔（mPTP）抑制剂环孢素A（CsA）处理细胞,探讨mPTP开放在C5b-9引起HK-2细胞铁死亡中的作用。结果通过皮肤过敏反应评分发现,Blank和Vehicle组小鼠背部皮肤未观察到明显红斑和水肿,致敏率为0。TCE、Fer-1和CD59组各有11、10和8只小鼠背部皮肤出现不同程度水肿或红斑,致敏率分别为45.83%（11/24）、43.47%（10/23）和42.11%（8/19）,各组之间致敏率差异无统计学意义。对TCE致敏小鼠肾皮质研究发现,TCE致敏显著升高小鼠肾小管中与脂质过氧化有关的酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和环氧合酶（COX2）的表达水平,而降低谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和谷胱甘肽（GSH）水平。同样地,TCE致敏阳性小鼠肾脏非血红素铁水平、ROS及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4HNE）水平显著升高,且4HNE主要表达于TCE致敏阳性小鼠肾小管。电镜观察发现TCE致敏阳性小鼠TECs线粒体嵴减少甚至消失、线粒体出现空泡样变性。而铁死亡抑制剂Fer-1预处理能显著改善TCE致敏引起的这些改变。这些结果说明TCE致敏能引起小鼠肾小管铁死亡。对肾小管损伤指标的分析发现,Fer-1预处理能显著减轻TCE致敏引起的肾小管空泡样变性并降低TCE致敏阳性小鼠血清和尿液中α1-微球蛋白（α1-MG）、β2-MG、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Ngal）和肾损伤分子-1（Kim-1）的水平。这暗示肾小管铁死亡参与了 TCE致敏引起的小鼠肾小管损伤。本研究同样发现TCE致敏能引起补体膜攻击复合物C5b-9在肾小管特异性沉积,而用外源性补体调节蛋白CD59预处理干扰C5b-9在肾小管的合成后,TCE致敏引起的铁死亡相关指标ACSL4、COX2、GPX4、非血红素铁、GSH、MDA、ROS和4HNE改变及线粒体损伤都明显改善。同样地,CD59还减轻了 TCE致敏引起的肾小管结构和功能损伤。这暗示着肾小管特异性C5b-9沉积可能在TCE致敏引起的小鼠肾小管细胞铁死亡和小管损伤中起重要作用。此外,在体外用C5b-9处理HK-2细胞同样发现,C5b-9能引起HK-2细胞活力降低、GSH耗竭、脂质过氧化产物堆积和细胞内Fe2+水平升高。有趣地是,细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理能显著改善C5b-9引起的HK-2细胞铁死亡。为探讨Ca2+在C5b-9引起肾小管铁死亡中的作用,我们检测了内质网Ca2+转运体IP3R的激活情况。结果发现,TCE致敏阳性小鼠肾脏IP3R被激活,而CD59预处理能阻断IP3R的激活。此外,在C5b-9处理的HK-2细胞中也同样发现了 IP3R水平的升高。深入研究发现,TCE致敏能引起胞质内Ca2+水平升高,激活线粒体Ca2+单向转运体MCU,导致线粒体膜电位去极化和线粒体氧化磷酸化相关蛋白（OXPHOS）水平的降低,而CD59预处理能减轻这些异常的改变。体外实验同样发现,C5b-9能引起HK-2细胞Ca2+超载并激活MCU,导致线粒体膜电位去极化和OXPHOS的降低。为研究IP3R在这系列反应中的作用,我们用siR干扰IP3R的表达。结果发现,IP3R siR预处理后,C5b-9引起的线粒体Ca2+超载和线粒体损伤都被减轻。此外,IP3R siR处理能减轻C5b-9引起的细胞活力的降低、GSH的耗竭、脂质过氧化物的堆积及细胞内Fe2+的升高。这说明IP3R激活引起的细胞内Ca2+超载和线粒体损伤在C5b-9介导的TCE致敏小鼠肾小管铁死亡中发挥重要作用。为进一步研究细胞质Ca2+超载是如何引起线粒体紊乱和铁死亡的,我们检测了线粒体mPTP的开放情况。结果发现,在TCE致敏阳性小鼠原代TECsmPTP被明显活化,而CD59预处理后mPTP活化情况被有效遏制。同样地,mPTP在C5b-9处理的HK-2细胞也明显被激活。此外,细胞内Ca2+螯合剂BAPTA-AM不仅能有效阻断C5b-9引起的mPTP活化,还能减轻C5b-9引起的线粒体去极化程度。进一步研究发现,mPTP活化被CsA抑制后,C5b-9引起的线粒体膜电位去极化和OXPHOS相关蛋白的降低也被显著减轻。此外,C5b-9引起的细胞活力的降低、GSH的耗竭、脂质过氧化物的堆积和游离Fe2+的升高也被CsA显著改善。这些结果说明mPTP的开放在C5b-9引起的线粒体紊乱和铁死亡中起重要作用。结论根据以上研究结果,本文得出以下结论:肾小管特异性C5b-9沉积通过激活内质网Ca2+转运体IP3R引起细胞内Ca2+超载、mPTP异常开放和线粒体损伤,最终介导TCE致敏小鼠TECs铁死亡和肾损伤。