研究背景:　　脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)为全球范围内较为常见的脑血管病，在所有脑血管疾病中约占10-30％，ICH的致残率以及病死率相当高，给家庭乃至社会带来沉重的负担，是威胁人类生命健康的三大类疾病之一。最近几十年来，尽管针对ICH的研究从未驻足，但至今为止其发病机制仍然不明朗，且治疗手段依然严重不足。因而，进一步深入研究ICH的发病机制及其防治手段，具有非常重要的意义。有研究发现，发病之初并非ICH病情最严重的时期，而是在出血后几天以后，随着继发性神经损伤的产生，进一步引起脑损伤以及神经功能缺损才是ICH的发病的严重状况。因此，近几十年来，有关ICH的继发性损伤发病机制以及防治手段探索逐渐成为医学界的研究热点。目前的研究认为，血肿周围代谢状态异常，红细胞裂解所诱发的炎症反应是引起神经功能缺损的主要因素，尤其是炎症反应在此过程中所产生的作用备受人们关注。研究发现，ICH后血肿周围的炎性细胞功能被激活，从而释放TNF-α等致炎因子，进而促使细胞间的粘附分子表达量上调，血脑屏障受到破坏，单核巨噬细胞、外周中性粒细胞等炎症细胞向血肿周围区域聚集，从而诱发炎症级联反应，加重神经细胞的死亡以及脑水肿的程度，最终导致神经功能缺损以及脑损伤加剧。但至今为止，脑出血导致炎症反应的下游级联关系仍不明晰。　　TLRs（Toll-like receptors）是近十多年来研究较为热门的受体，目前为止发现人类基因组中共有11种TLR，命名分别为TLR1-11，它属于IL-1受体超家族成员，是人类经过长期进化而保留的天然防御机制之一，能介导天然免疫。TLR4在革兰阴性菌感染过程中作为各种内毒素的跨膜受体的作用而得到广泛认同。此外，早期有实验证实TLR4能参与脑缺血再灌注损伤，TLR4激活的炎症反应是缺血性脑卒中后继发性脑水肿形成的重要环节，但 TLR4是否通过介导炎性机制在脑水肿形成的病理演变过程中发挥作用，尚不得而知。肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）是一种重要的炎性因子，高等动物体内主要由单核巨噬细胞可以产生，此外在脑神经元、各种免疫细胞以及某些肿瘤细胞等均可以生成。TNF-α能够促进血小板活化因子以及血管内皮细胞组织因子的产生，进而影响某些血管收缩活性物质的表达，通过细胞间粘附分子诱导炎症细胞向神经组织方向迁移，参与炎症反应。水通道蛋白4(Aquaporin4，AQP4)是一种与水通透相关的跨膜转运蛋白，水分子能在大脑内流动主要是靠AQP4提供的关键通道，因而AQP4是反应脑水肿的重要指标，其影响水分子的跨膜转运和控制细胞内外水势平衡。此前有脑水肿实验模型表明，AQP4在各种因素引起的脑水肿的发生与发展过程中扮演着重要的角色。TNF-α等炎性因子诱发脑水肿可能是通过多种机制破坏正常的血脑屏障，进而诱导AQP4表达上调，从而加重脑水肿状况，产生级联放大效应。而 TLR4作为炎性信号通路的关键受体，能激活其信号通路下游的炎性反应，从而介导炎性损伤，此中过程极有可能是通过上调AQP4的表达，介导脑水肿的形成。　　TLR4炎性信号转导激活后，启动通路下游一系列的炎症反应，进而激活炎症细胞，分泌炎性因子，产生级联放大效应，从而加剧炎性损伤，此过程是缺血性脑卒中继发性脑水肿形成的关键环节。因 TLR4具有强大的炎性效应，所以TLR4很有可能在脑出血继发性脑损伤的炎性机制中具有关键作用，但TLR4是否通过介导炎性反应，上调 AQP4表达参与脑出血后脑水肿形成，国内外尚未有研究报道证实。本课题采用大鼠脑出血模型，研究 TLR4及其炎性反应途径下游相关指标TNF-α，与AQP4及脑水肿的相关性及联系，探索脑出血后继发性损伤中脑水肿形成的炎性机制，将有助于开发调节 TLR4信号通路的拮抗剂，对阻断炎性级联反应下游信号转导，遏制炎症瀑布效应，减轻水肿，减少神经元的凋亡，挽救神经功能，改善预后，具有重要临床意义，为临床治疗提供最新思路。　　研究目的:　　明确 TLR4、TNF-α、AQP4表达与脑出血后继发性损伤脑水肿的关系，为临床治疗提供最新思路。　　研究方法:　　1.大鼠实验性脑出血模型的制备及评估　　选择健康雄性SD大鼠70只，体重约250-300g，将其随机分为手术组(n=30)、假手术组(n=30)、空白对照组(n=10)。其中手术组与假手术组按手术后分别于1小时、6小时、1天、3天、5天、7天每个时间点各取5只大鼠，处死后对大鼠右侧大脑半球穿刺点前半部的脑组织分别称量湿重，经烘干后再称干重，计算含水量；冠状脑切片行HE染色病理观察。　　2. TLR4、TNF-α、AQP4时效性表达实时荧光定量PCR方法检测　　取各实验组脑出血血肿周围脑组织100mg，以Trizol法提取总RNA，进行反转录反应以及实时荧光定量PCR（Q-PCR），以GAPDH基因作为内参，计算TLR4、TNF-α、AQP4 mRNA相对表达水平。　　3. TLR4、TNF-α、AQP4蛋白表达免疫组化检测　　采用SP法，进行TLR4、TNF-α、AQP4蛋白表达阳性细胞测定。对样本进行石蜡包埋切片，切片分别滴加TLR4、TNF-α、AQP4蛋白抗体，4℃孵育过夜；然后滴加山羊抗兔IgG；37℃20min；滴加SABC，37℃20min，各步骤用PBS洗3min×3次；DAB显色剂，木素轻度复染，脱水透明，封片。显微图像分析系统采集图像，分析阳性细胞积分光密度。　　4. TLR4、TNF-α、AQP4蛋白表达Western Blot检测　　取各实验组脑出血血肿周围脑组织100mg，提取总蛋白后进行蛋白定量，采用SDS-PAGE电泳后，以PVDF膜转膜和孵育抗体，5%脱脂奶粉-TBS封闭，滴加一抗室温孵育2h。TBS洗涤 PVDF膜5min×5次，滴加二抗室温孵育1h后，以TBS洗5min×5次，化学发光，显影，定影，计算TLR4、TNF-α、AQP4蛋白的表达水平。　　结果:　　1、造模后发现大鼠对侧肢体瘫痪，表现为自发左转活动，且行动较为迟缓。行为学评分显示手术组大鼠1h-7d神经功能缺损评分明显高于手术前，差异显著(P<0.05)，且ICH6h评分最高，之后逐渐下降，脑出血对大鼠肢体运动有较大的影响，提示ICH造模成功。　　2、手术组脑组织含水量在脑出血后6h时开始升高，3d时到达高峰，5d有所降低；1h时、6h与7d手术组与假手术组两组间比较无统计学差异（P>0.05），但1d、3d以及5d时手术组与假手术组相比脑组织含水量增高差异具有统计学差异（P<0.05）。　　3、脑出血造模后，研究发现TLR4 mRNA在造模后1d开始增加，在3d达到高峰，在5d下降；TNF-α mRNA在造模后1d增加，此后逐渐增加，第7天最高；AQP4 mRNA在造模后3d增加，在5d达到高峰，在7d下降。　　4、脑出血造模后，免疫组化检测发现同假手术组相比，手术组在脑出血后TLR4阳性细胞百分比于6h开始增多，3d达高峰，5d时有所下降；手术组在脑出血后TNF-α阳性细胞数百分比于1d时开始增多，3d达高峰，5d时开始下降；手术组在脑出血后AQP-4阳性细胞数百分比于1d时已经升高，3d达高峰，5d时开始下降。　　5、脑出血造模后，Western Blot检测研究发现TLR4蛋白水平在造模后6h开始增加，在3d达到高峰，在5d下降；TNF-α蛋白水平在造模后1d增加，此后逐渐增加，7d最高；AQP4蛋白水平在造模后1d增加，在3d达到高峰，在7d下降。　　结论:　　1、TLR4、TNF-α、AQP4在大鼠脑出血后的血肿周围脑组织表达增高，呈现时效性反应趋势。　　2、TLR4介导的炎症反应途径，通过上调TNF-α与AQP4表达参与脑出血后继发性损伤中脑水肿的形成。