研究背景:乳腺癌在全球女性癌症中患病率高达第一,死亡率高达第二,其高死亡率的主要原因是肿瘤转移。在肿瘤转移的早期,淋巴转移是肿瘤细胞扩散的主要途径,而距离原发肿瘤最近的前哨淋巴结通常是淋巴结转移的首要部位,一旦受到肿瘤细胞的侵袭,前哨淋巴结会成为肿瘤细胞形成的蓄水池,并由此向身体其他部位转移。此外,手术后转移淋巴结的潜伏活动显著增加了癌症复发和远处转移的风险。因此,前哨淋巴结是有效治疗肿瘤转移的首要靶点。近年来研究发现,全身化疗药物往往滞留在血液或器官内,难以进入淋巴系统,严重影响对淋巴转移的治疗效果。最近研究表明,纳米载体可以将药物输送到转移的肿瘤部位,从而为转移性肿瘤靶向治疗提供新的手段。然而,纳米制剂通过局部注射在转移淋巴结中的蓄积在很大程度上是有限的,因为转移瘤在多个结节中的高度分散,手术区域以外的淋巴转移的发生率,以及肿瘤中淋巴引流的损害,以及其他困难。静脉注射抗癌药物很难到达淋巴系统。更糟糕的是,化疗药物在转移的淋巴结内蓄积有限、滞留时间短、渗透性差,极大地限制了它们与癌细胞的相互作用,从而影响了对淋巴转移的治疗效果。解决这些问题的新策略是通过静脉注射改善转移淋巴结的药物输送,从而对转移性淋巴结进行靶向治疗。脂质体由于具有良好的生物相容性和多种功能,在纳米材料给药系统中得到了广泛的应用,包括提高药物分子的溶解度、防止降解和降低毒性。近年来,光热疗法可以有效地破坏肿瘤组织,同时对周围正常组织的损害很小。四氧化三铁纳米粒子由于具有较强的磁响应性、低毒性、良好的生物相容性和生物降解性等优点被广泛应用于药物传递系统,并且近期发现其在近红外激光照射下具有良好的光热转换效率,因此,四氧化三铁的光热疗法在肿瘤治疗中的应用受到了越来越多的关注。蟾毒灵是一种从中药蟾酥中提取的强心类固醇,因其在体外和体内对包括乳腺癌在内的多种癌症的抗癌活性而受到广泛关注。然而蟾毒灵的潜在副作用和毒性,严重限制了蟾毒灵制剂应用于临床。此外,最近的研究发现,化学疗法和光热疗法的联合应用在提高抗癌药物的疗效和减少不良反应方面具有巨大的潜力。将四氧化三铁纳米粒和中药有效成分蟾毒灵制备成脂质体纳米给药系统,对前哨淋巴结转移性肿瘤进行光热-化疗联合治疗,可能是转移性乳腺癌治疗的新策略。研究目的:本研究设计了一种以超顺磁性Fe3O4纳米粒为光热剂和磁靶向剂,包载中药有效成分蟾毒灵（Bufalin）的光磁双敏感脂质体（Bufalin-Fe3O4-liposome,BF-Fe3O4-L）。在磁场作用下,蟾毒灵光磁双敏感脂质体（BF-Fe304-L）靶向聚集在肿瘤附近的前哨淋巴结,经808 nm近红外激光照射,BF-Fe3O4-L中的Fe3O4纳米粒可以有效地将光能转换成热能,升高局部肿瘤温度,对前哨淋巴结转移性乳腺癌进行光热治疗。同时蟾毒灵从脂质体中释放,对转移性乳腺癌进行化学治疗,最终实现对前哨淋巴结转移性乳腺癌的光热-化疗联合治疗。研究方法:1、超顺磁性Fe3O4纳米粒的制备与表征采用化学共沉淀法制备了油酸包裹的超顺磁性Fe304纳米粒,通过X射线衍射法对制备的Fe3O4纳米粒进行结构验证,再通过透射显微镜对Fe3O4纳米粒的形貌进行观察,使用振动样品磁强计测定Fe3O4纳米粒的磁性能。2、BF-Fe3O4-L的制备与表征采用薄膜分散法制备BF-Fe3O4-L,首先,进行了 BF-Fe3O4-L的处方考察。随后,对优化处方制备的BF-Fe3O4-L的形态、粒径、PDI、包封率、体外释放特性、体外磁响应性能、体外光热性能、储存稳定性等进行表征与考察。3、BF-Fe3O4-L的细胞摄取实验按照BF-Fe3O4-L的制备工艺,制备包裹荧光染料IR-780或DiR碘化物的光磁双敏感脂质体（IR780-Fe3O4-L/DiR-Fe3O4-L）,以高转移性小鼠乳腺癌细胞（4T1）为细胞模型,采用流式细胞仪及激光共聚焦显微镜对细胞的摄取情况进行考察。4、BF-Fe3O4-L的体外抗肿瘤活性实验以高转移性小鼠乳腺癌细胞（4T1）为模型,通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）法对BF-Fe3O4-L的体外抗肿瘤活性进行评价。5、BF-Fe3O4-L的肿瘤靶向及组织分布研究以荷4T1细胞的淋巴转移雌性Balb/c小鼠为动物模型,制备DiR-Fe3O4-L,通过尾静脉注射给予小鼠药物,在前哨淋巴结部位施加磁场,2h后移除,于设定时间点,采用小动物活体成像仪研究BF-Fe3O4-L的肿瘤靶向情况。实验结束后处死小鼠,收集前哨淋巴结进行体外荧光成像。6、BF-Fe3O4-L对前哨淋巴结转移性肿瘤治疗效果评估以荷4T1细胞的淋巴转移雌性Balb/c小鼠为动物模型,将小鼠随机分为7个实验组,分别为:PBS组、PBS近红外激光照射组、Fe3O4-L组、Fe3O4-L近红外激光照射组、游离BF组、BF-Fe3O4-L组、BF-Fe3O4-L近红外激光照射。通过尾静脉注射给予药物,在前哨淋巴结部位施加磁场,2h后移除,药物在前哨淋巴结部位分布达峰后,对前哨淋巴结表面进行808 nm近红外激光照射,给药后,每三天记录一次小鼠体重及肿瘤体积变化,共观察15天,15天后处死小鼠,将离体前哨淋巴结组织称重并拍照,通过TUNEL染色对各组前哨淋巴结组织进行组织学检查。采用苏木精伊红染色对各组肺组织进行组织学检查。进行BF-Fe3O4-L光热-化疗联合治疗转移性乳腺癌药效学评价。研究结果:1、Fe3O4纳米粒的表征Fe3O4纳米粒的TEM结果表明合成的Fe3O4纳米粒具备良好的分散性,平均粒径为10～15 nm。Fe3O4纳米粒X射线衍射图谱与XRD标准卡片JCPDS#019-0629进行对照,证明合成产物是Fe3O4。Fe3O4纳米粒的磁性能由磁滞回线显示,Fe3O4纳米粒的饱和磁化值为76 emu/g,并且矫顽力以及磁剩余量几乎为零,表明制备的Fe3O4纳米粒为超顺磁性。2、BF-Fe3O4-L的制备及表征BF-Fe3O4-L 的最佳制备工艺为:2.0 mL DPPC（2.25 mg/mL,二氯甲烷）、0.5 mL Chol Chol-PEG2000（6 mg/mL,二氯甲烷）、0.1 mL Chol（1 mg/mL,二氯甲烷）、0.13 mLFe3O4（5 mg/mL,三氯甲烷）、0.1 mLBF（2 mg/mL,甲醇）加入 100 mL 茄形瓶中,水浴超声混匀后,37℃下减压蒸发,使脂类材料在茄形瓶底部形成均匀的脂质层,向茄形瓶中分两次各加入1 mL纯净水,经37℃水浴超声充分水化形成粗脂质体,采用脂质体挤出器,依次通过800、400、200、100 nm的滤膜进行整粒。TEM结果表明BF-Fe3O4-L的性状近似球形,通过马尔文粒度仪测得其粒径约为136.8±0.9 nm,PDI为0.175±0.012。通过冷冻离心法和高效液相色谱法测得其包封率为95.8%,载药量为2.27%。体外磁响应性实验结果表明BF-Fe3O4-L在外加磁场下具有良好的磁响应性。红外热像仪结果表明BF-Fe3O4-L溶液在808 nm近红外激光照射5 min后,溶液温度从32.0℃逐渐升高至72.3℃,最终趋于稳定,表明BF-Fe3O4-L具有良好的光热转换能力。3、BF-Fe3O4-L的肿瘤细胞摄取水平激光共聚焦显微镜结果显示Fe3O4-L增加了 IR780的细胞摄取,并且在外加磁场作用下,细胞对IR780-Fe3O4-L的摄取水平进一步提高。此外,DiR-Fe3O4-L在近红外激光照射下,DiR红色荧光信号与溶酶体绿色荧光信号几乎不重合,部分DiR红色荧光信号分布在细胞核中,在未光照组,红色和绿色荧光信号几乎完全重合,表明近红外激光照射能促进DiR从溶酶体中逃逸。结果表明,近红外激光照射能促进药物在被肿瘤细胞摄取后从溶酶体中释放进入细胞核,从而增强靶向抗肿瘤活性。4、BF-Fe3O4-L的体外细胞毒性肿瘤细胞毒性实验表明,蟾毒灵浓度为16 μg/mL时,细胞存活率仅为32.0%。结果表明,蟾毒灵对4T1细胞具有较强的细胞增殖抑制作用。BF-Fe3O4-L近红外激光照射组与未光照组相比,4T1细胞活性显著降低,P＜0.01。表明BF-Fe3O4-L在近红外激光照射下产生了光热-化疗联合抗肿瘤作用。5、BF-Fe3O4-L的肿瘤及磁响应性在体内组织分布实验中,与游离DiR相比,DiR-Fe3O4-L在前哨淋巴结肿瘤部位的信号显著增强,表明Fe3O4-L可以有效地在肿瘤部位积聚,具有肿瘤靶向能力。在磁场作用下,DiR-Fe3O4-L在前哨淋巴结肿瘤部位的信号进一步增加,表明外加磁场能够增加DiR-Fe3O4-L在前哨淋巴结部位的分布。6、BF-Fe3O4-L的体内抗肿瘤效果。在体内抗肿瘤实验中,PBS组、PBS光照组、空白Fe3O4-L组小鼠前哨淋巴结肿瘤生长未受到抑制。而游离BF组、BF-Fe3O4-L组、BF-Fe3O4-L光照组均能抑制肿瘤生长。并且,在相同条件下,与BF-Fe3O4-L组相比,BF-Fe3O4-L光照组表现出更显著的肿瘤抑制作用,表明BF-Fe304-L在近红外激光照射下能够产生光热-化疗联合抗肿瘤作用。治疗15天后,与PBS组相比,BF-Fe3O4-L光照组前哨淋巴结肿瘤抑制率为91.0%,肺转移发生率降低81.5%,表明BF-Fe3O4-L能够有效抑制前哨淋巴结转移性乳腺癌的生长及远端肺转移。结论及意义:本文建立了光磁双敏感蟾毒灵脂质体（BF-Fe3O4-L）的制备工艺,BF-Fe3O4-L具有良好的磁靶向性及光热转换性能。在体内外实验中,证明了 BF-Fe3O4-L具有磁靶向肿瘤的能力,提高药物在肿瘤部位的蓄积。BF-Fe3O4-L在808 nm近红外激光照射下,产生光热-化疗联合抗肿瘤作用,有效抑制足部肿瘤,前哨淋巴结转移性肿瘤的生长及远端肺转移的发生。本文的研究结果提示BF-Fe3O4-L可以作为转移性乳腺癌靶向治疗药物,具有一定的临床应用前景。