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蜕皮类固醇对节肢动物生长、发育和繁殖有重要调控作用,其滴度的周期性波动调控节肢动物周期性蜕皮和发育,20E是大部分节肢动物具有活性的蜕皮激素。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)隶属于甲壳纲,青蟹属,其营养价值高,是我国比较受欢迎的一种重要的经济养殖蟹类。本文将拟穴青蟹作为研究对象,发掘鉴定20E代谢途径中的几个重要调控基因,对这些基因在幼体不同发育时期、雌雄不同组织以及不同蜕皮时期的表达模式进行分析,为蜕皮激素的浓度调控奠定一定基础1.蜕皮激素代谢通路相关基因的发掘鉴定参考昆虫中20E代谢通路的研究,在拟穴青蟹转录组中初步鉴定到7个可能参与蜕皮激素代谢相关基因中的5个基因,包括可能参与合成的Nvd、CYP307al、CYP302al、CYP315al基因和可能参与代谢的CYP18a1基因。除Nvd外,其它基因均属于P450家族成员,包括未鉴定到的CYP306a1和CYP314a1基因。而这两个基因均在蚤状溞中获得,而南美白对虾中似乎也未找到CYP314a1,可能原因是这两个基因可能具有较高的时期或组织特异性,或是它们在进化中保守性较低。对Nvd、CYP302a1、CYP315a1和CYP18a1的基因的ORF区域进行了一代测序校正,并对这些基因的生物信息学特征进行了综合分析。对P450基因进行进化关系分析,发现青蟹的几个基因均聚到对应的P450类群,且具有较高的节点支持率,提示所鉴定到的基因具有一定保守性。Sp-Nvd基因编码的氨基酸预测蛋白分子量为52.37 KDa,CYP302a1、CYP315a1及CYP18a1基因编码的氨基酸预测蛋白分子量分别为61.14、62.41和60.35,,基本与其他脊椎动物和无脊椎动物细胞色素P450(56-62k Da)的大小保持一致;理论等电点分别为8.39、8.76、6.74、7.96。此外,Signal 5.0 Server和TMHMM分析发现Sp-Nvd、Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1的氨基酸序列均无信号肽序列,仅Sp-Nvd和Sp-CYP18a1的氨基酸序列N末端各含有1个推测的跨膜结构域。此外,序列分析还发现Sp-Nvd含有Nvd中参与酶催化的两个保守结构域:一个Rieske[2Fe-2S]特征域和一个non-heme Fe(II)结合基序,Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1的氨基酸序列均氨基酸序列含有helix-K、helix-C、helix-I、PERF及heme-binding共5个P450特征保守区域及N端的PG富集区。2.蜕皮激素代谢通路基因的组织表达模式基因的功能与其组织分布具有密切关系。甲壳动物中蜕皮激素主要以外源胆固醇为原料在Y器官(YO)合成分泌。对鉴定到的4个20E代谢相关的基因(Nvd、CYP302a1、CYP315a1和CYP18a1基因)在雌雄不同组织表达模式进行了分析。结果显示:三个参与合成Sp-Nvd、Sp-CYP302a1和Sp-CYP315a1在所检测的雌蟹和雄蟹不同组织中均有表达,均在Y器官具有最高表达,而在其他组织中表达量相对较低,这与YO为蜕皮激素合成器官的结果一致。有意思的是,可能参与20E降解的Sp-CYP18a1在YO中具有最高的表达量,此外,Sp-CYP18a1在雌蟹的胸神经节、表皮和中肠,雄蟹的心脏和中肠中也有有较高的表达,在其他所检测的组织中具有较低的表达量,对CYP18a1的YO器官高表达值得进一步深入研究。此外,发现Sp-Nvd、Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1在雌性拟穴青蟹中表达量明显高于雄性个体,提示蜕皮激素滴度可能在雌雄生长发育过程中效应不同。在果蝇中也发现了类似现象,目前尚不清楚这种差异的意义,仍需要进一步研究。3.蜕皮激素代谢基因在蜕皮周期内和幼体发育过程的表达变化蜕皮激素最典型的作用是在蜕皮周期内周期性的波动引发蜕壳,因此对蜕皮周期内相关基因的表达变化模式分析具有重要意义。我们检测了Sp-Nvd、Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1基因在不同蜕皮时期的表达量,并分析其表达调控模式。结果显示,在一个蜕皮周期内,Sp-Nvd基因在蜕皮周期内变化显著,此外,Sp-CYP302a1和Sp-CYP315al同样在蜕皮周期内变化显著,均在蜕皮前期(D期)具有最高表达量,随后均开始下降,且其变化趋势均与个体20E需求量的变化趋势相同,表明对20E代谢过程中具有重要作用。我们也分析了Sp-CYP18al在YO和He中的变化规律,其在两组织中的变化模式保持一致,在蜕皮周期中变化显著,均在蜕皮期(E期)具有最高表达量,而在蜕皮后期的B期的表达量相对较低,提示Sp-CYP18al在20E代谢过程中具有比较重要的作用。有意思的是,Sp-CYP18al在A、C和E期的YO组织中的也具有相对较高的表达量,此外其组织表达模式表明其在蜕皮激素的合成器官YO中表达量较高,综合表明其功能可能发生了一定进化,仍需进一步研究。此外,还分析了这些基因在青蟹幼体发育过程的变化规律。结果显示,在幼体发育过程中Sp-Nvd、Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1基因的表达均具有显著变化,这提示这些基因的功能与幼体发育具有极为密切的关系。有意思的是,Sp-Nvd、Sp-CYP302a1、Sp-CYP315a1和Sp-CYP18a1在Z3时期前后出现表达量的峰值,在实际生产过程中,Z1和Z2期主要以轮虫为饵料,自Z3时期会开始增加卤虫幼体作为其生物饵料,这些现象是否具有一定联系值得进一步探讨。综上所述,在拟穴青蟹中初步鉴定了7个可能参与蜕皮激素代谢中的5个基因,包括Nvd、CYP307al、CYP302al、CYP315al和CYP18a1,对其中4个基因的ORF序列进行了一代测序校正以及初步分析。结果显示Sp-CYP302a1和Sp-CYP315a1基因的序列特征、组织分布模式以及蜕皮周期内的变化规律与推测的20E的合成以及变化规律一致,但Sp-Nvd和Sp-CYP18a1的不一致,这可能是这些基因的功能具有一定多样性,值得进一步的研究。综合起来看,Sp-CYP302a1基因具有作为20E滴度变化的指示基因的可能,本论文可为相关研究提供基础资料。