论文部分内容阅读
目的:通过观察淫羊藿次苷Ⅱ(IcarisideⅡ,ICSⅡ)诱导人羊膜间充质干细胞(Human Amnion Mesenchymal Stem Cells,h AMSCs)分化后细胞的表达产物及PI3K信号通路抑制剂对诱导分化的影响,探讨ICSⅡ诱导h AMSCs分化的效应及作用机制。方法:(1)流式细胞仪鉴定P4代h AMSCs表型后,将其种入细胞培养板和培养瓶中作为受试细胞。(2)根据预实验结果,在高糖DMEM培养基基础上配备含ICSⅡ浓度为10μmol/L、3μmol/L、1μmol/L和0μmol/L,DMSO体积分数3‰的诱导培养基。将受试细胞随机分为A组、B组、C组、对照组和抑制剂组,前4组分别加入对应的诱导培养基1m L,抑制剂组用PI3K特异性抑制剂LY294002 20μmol/L预先处理h AMSCs1h,再加入B组体系进行诱导。各组均间隔48h换液。(3)诱导6h、7d和21d时,应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态及记录细胞长度。诱导21d时采用免疫荧光法检测各组Neu N、NSE、MAP-2、GFAP和TH的表达,并计算阳性细胞表达百分比;应用蛋白质印迹法检测各组NSE、MAP-2、GFAP和TH的相对表达量;ELISA法检测诱导培养基上清液中多巴胺的浓度。结果:(1)原代及传代hAMSCs在含血清的LG-DMEM/F12培养基中增殖迅速,细胞呈巢状或漩涡状排列。流式细胞仪检测,P4代细胞高表达CD44、CD73、CD105、CD90间充质干细胞相关表面抗原,不表达CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR。(2)倒置相差显微镜下观察显示:诱导培养6h时,各组细胞形态无明显变化,细胞长度差异无统计学意义(P>0.05)。诱导培养7d时,A组、B组、C组均出现双极神经元样细胞,抑制剂组细胞形态宽大呈梭形,细胞密度增大,对照组细胞数量增多,相互融合;与对照组比较,A组、B组、C组和抑制剂组细胞明显延长(P<0.05),A和B组比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组均较C组和抑制剂组明显延长(P<0.05)。诱导培养21d,A组、B组和C组双极神经元样细胞数明显增多,抑制剂组细胞间相互融合,对照组细胞铺满培养孔;与对照组比较,A组、B组、C组和抑制剂组细胞明显延长(P<0.05);与抑制剂组,A组、B组、C组细胞均延长(P<0.05);B组较其他各组细胞均延长(P<0.05)。(3)诱导21d时免疫荧光显示:各组GFAP表达均不明显。Neu N、NSE、MAP-2和TH在各组均有表达,A组、B组和C组表达较强,抑制剂组和对照组表达微弱,B、A组和C组Neu N表达于细胞核,但A组和C组部分细胞质中也有表达,NSE、MAP-2和TH表达于细胞质。Neu N、NSE、MAP-2和TH阳性细胞率A组、B组和C组较抑制剂组和对照组增高(P<0.05),抑制剂组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),A组与B组Neu N、MAP-2和TH阳性细胞率差异无统计学意义(P>0.05),但均较C组高(P<0.05);B组NSE阳性细胞率较A组、C组高(P<0.05)。(4)诱导21d时Western-blot结果示:GFAP在各组中均不表达。A组、B组和C组NSE、MAP-2、TH表达较抑制剂组、对照组明显增加(P<0.05),A组、B组和C组NSE、TH表达差异无统计学意义(P>0.05),但A组、B组MAP-2表达量较C组多(P<0.05)。(5)诱导21d时ELISA结果示:A组、B组、C组培养基上清液中多巴胺浓度均较抑制剂组和对照组增高(P<0.05),A较B组、C组高(P<0.05),B组较C组高(P<0.05)。结论:在本实验条件下,ICSⅡ可诱导h AMSCs向多巴胺能神经元样细胞分化,诱导浓度以3-10μmol/L最佳,PI3K信号通路参与了诱导分化过程。