研究背景宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,在世界范围内,宫颈癌在女性癌症发病率中居于第四位,也是女性患者因癌症死亡的第四大常见原因。其中,发展中国家的宫颈癌患者约占70%,在低收入国家,宫颈癌是癌症死亡的最常见原因之一。影响宫颈癌发病的因素众多,不同地区和国家的宫颈癌发病率各不相同,国际癌症研究机构(International Agency of Research on Cancer,IARC)的一项调查结果表明,2012年,大约85%的宫颈癌发生在欠发达地区,在女性癌症患者中的占比是12%;但是,在发达国家,宫颈癌的发病率仅占女性癌症发病率的3%。而在中国,由于人口众多,不同地区经济发展不平衡,不同地区宫颈癌的发病率也存在着显著差异。而且对于西部或偏远山区而言,由于经济不发达,医疗卫生设施落后和医务人员紧缺,适合发达国家或地区的宫颈癌筛查办法难得得到广泛的开展。宫颈癌发生发展最重要的原因是持续性的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染。99%的宫颈肿瘤中可以检测到HPV,特别是诸如HPV 16和HPV 18两种致癌的病毒亚型。在一些发达国家,全国范围的细胞学筛查大大降低了宫颈癌的死亡率。但是,根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的建议,只有在宫颈癌筛查覆盖率超过80%时,降低宫颈癌死亡率和发病率的任务才有可能达成。因此,增加宫颈癌筛查的覆盖率相较增加筛查频率而言更为重要。然而,在发展中国家,由于缺乏有组织的筛查计划,宫颈癌患者的死亡率仍然居高不下。包括早期诊断在内的综合干预可以有效的降低全球范围内的宫颈癌死亡率(Cervical Cancer:World Health Organization,2017),因此,寻找新的具有早期诊断价值和预后判断的生物标志物对于宫颈癌患者的早期诊断、治疗期间的疾病管理都具有非常重要的意义。仅有四个半 LIM(four and a half LIM domain protein,FHL)的蛋白质亚家族属于LIM-only的蛋白质家族。该家族中的蛋白质可能来自共同起源的基因复制品,并且在其氨基酸序列中具有高度的同源性。LIM的名称来源于转录因子LIN-11,ISL-1和MEC-3的首字母,以此来表示其原始的结构域。基于这些结构域高度保守的富含半胱氨酸的锌指状交互序列,它们被认为是充当多蛋白质复合物组装的停靠位点,因此,LIM结构域是蛋白质相互作用的重要介质。FHL2是FHL蛋白家族中的一种,也是目前为止被研究得最深入的一种。FHL2对分子通路多样性的影响表明其在多种疾病的生理、病例过程中扮演重要的角色。值得一提的是,FHL2在癌症的发生发展过程中扮演着双重角色,近年来的诸多研究表明,FHL2以细胞类型依赖性的方式既可以起到癌基因的作用,也可以发挥抑癌基因的功能。Yan等人在2003年首次阐明FHL2是乳腺癌发病机制中至关重要的影响因素。FHL2在消化道肿瘤如结肠癌中高度表达,其中FHL2是癌细胞的细胞周期和生长调节剂,与此同时,也有研究发现FHL2的表达在肝细胞癌的临床样本中总是下调,表明FHL2具有肿瘤抑制的特性。FHL2对癌细胞的侵袭,迁移和对细胞外基质的黏附至关重要;然而,到目前为止,FHL2在宫颈癌中的作用尚未阐明。本研究旨在通过体内和体外试验分析宫颈癌中FHL2的表达情况及其对宫颈癌患者预后的影响,同时详细探讨FHL2对宫颈肿瘤致瘤性以及对癌细胞凋亡、增殖的影响。此外,探讨FHL2参与宫颈癌发展的可能分子信号通路。根据实验设计,本课题共分为三个部分:第一部分:FHL2在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌患者预后的影响研究目的1.检测FHL2在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达情况,分析宫颈癌组织中FHL2的表达水平与宫颈癌患者临床病理指标之间的相关性。2.探讨FHL2在宫颈癌组织中的表达水平与宫颈癌患者预后的相关性。研究方法收集山东大学齐鲁医院妇产科2011年1月至2012年12月期间52例宫颈癌行手术治疗患者的宫颈癌组织及对应的癌旁组织,同时收集以上患者的临床病理资料,通过患者术后出院的持续回访,收集术后5年内患者生存情况的统计资料用于后续分析。应用免疫组织化学法检测FHL2在宫颈癌组织和癌旁组织的表达情况。分析宫颈癌组织中FHL2的表达水平与宫颈癌患者年龄、组织学类型、分化程度、肿瘤大小、间质浸润程度、淋巴结转移、淋巴管间隙浸润及FIGO分期之间的相关性。通过Kaplan-Meier生存曲线分析患者宫颈癌组织中FHL2表达水平与术后五年生存时间的相关性,从而判断FHL2的表达水平对宫颈癌患者预后的影响。研究结果1.免疫组化染色(200x)显示FHL2主要表达于肿瘤组织的细胞核中。2.实时定量PCR结果表明宫颈癌组织中FHL2 mRNA的表达水平显著高于癌旁组织。3.Western blotting结果显示宫颈癌组织中FHL2的蛋白表达水平显著高于癌旁组织。4.FHL2表达水平与临床病理资料的分析显示:宫颈癌患者不同的分化程度、间质浸润深度、淋巴结是否转移、淋巴脉管间隙是否浸润以及不同FIGO分期中宫颈癌细胞的FHL2表达水平有统计学差异(P<0.05),而不同年龄、组织学类型和肿瘤大小的患者中FHL2表达水平无统计学差异。5.Kaplan-Meier生存曲线显示:FHL2高表达组的总生存时间较短。研究结论1.宫颈癌组织中FHL2的表达显著高于癌旁组织。2.宫颈癌细胞中FHL2的表达与肿瘤的分化程度、间质浸润深度、淋巴结是否转移、淋巴脉管间隙是否浸润以及FIGO分期有关,可能作为癌基因参与宫颈癌的发生发展。3.FHL2高表达的宫颈癌患者预后较差,可作为预后判断的指标。第二部分:FHL2对宫颈癌细胞凋亡、增殖的影响及机制研究研究目的1.检测FHL2表达下调对宫颈癌细胞生物学行为的影响2.检测FHL2表达上调对宫颈癌细胞生物学行为的影响3.探讨FHL2影响宫颈癌细胞生物学行为的可能机制研究方法选取4组宫颈癌细胞系(HeLa组、CaSki组、SiHa组和C33a组)做培养,通过实时定量PCR法检测4组肿瘤细胞中FHL2 mRNA的水平,同时用Western blotting检测4组肿瘤细胞中FHL2蛋白的表达水平,分析两种方法的检测结果确定用于后续研究的宫颈癌细胞系。再选取3组FHL2siRNA(siRNA955、siRNA623、siRNA485)转染选定的宫颈癌细胞,通过Western blotting检测3组FHL2 siRNA的干扰效率,选取干扰效果最好的一组FHL2 siRNA用于后续研究。然后通过流式细胞术、Western blotting和CCK-8分别检测FHL2表达下调和上调时不同组别宫颈癌细胞凋亡和增殖的情况。最后,通过Western blotting检测FHL2 siRNA转染宫颈癌细胞中AKT/mTOR信号通路关键蛋白p-AKT和p-Mtor的表达水平,探究FHL2影响宫颈癌细胞生物学行为的可能机制。研究结果1.RT-PCR显示,4组宫颈癌细胞系中HeLa组和CaSki组的FHL2mRNA水平显著高于SiHa组和C33a组;Western blotting结果显示,4组宫颈癌细胞系中HeLa组和CaSki组的FHL2蛋白水平显著高于SiHa组和C33a组;因此选择HeLa细胞系和CaSki细胞系用于后续研究。2.RT-PCR显示,与阴性对照组相比,转染的三组siRNA(siRNA955、siRNA623、siRNA485)均有显著干扰作用,其中siRNA955在HeLa细胞系和CaSki细胞系中的干扰效率最高(FHL2的蛋白表达水平最低),且siRNA955转染的细胞系中FHL2水平显著降低,因此选择siRNA955用于后续研究用于抑制FHL2的作用。3.流式细胞术显示,siRNA955转染的HeLa细胞和CaSki细胞与对照组相比,细胞凋亡水平显著升高;Western blotting显示,siRNA955转染的HeLa细胞和CaSki细胞与对照组相比,细胞凋亡相关蛋白有显著差异,其中Bax蛋白(发挥促进凋亡作用)显著升高,Bcl2蛋白(发挥抑制凋亡作用)显著降低。4.CCK8检测显示,siRNA955转染的HeLa细胞和CaSki细胞与对照组相比,宫颈癌细胞的增殖受到明显抑制。5.Western blotting 显示,FLAG-NC(阴性对照)和 FLAG-FHL2 转染的 HeLa 细胞和CaSki细胞与对照组相比,FLAG-FHL2转染的细胞中FHL2的表达显著增高,证明FLAG-FHL2能诱导宫颈癌细胞FHL2的过表达。此后CCK8检测显示,FLAG-FHL2转染的HeLa细胞和CaSki细胞与对照组相比,宫颈癌细胞的增殖得到明显促进。6.Western blotting显示,siRNA955转染的HeLa细胞和CaSki细胞与对照组相比,p-AKT和p-Mtor的表达显著下降。研究结论1.宫颈癌细胞系中FHL2表达上调且能被siRNA抑制。2.FHL2表达下调可以诱导宫颈癌细胞的凋亡并抑制其增殖,FHL2表达上调可以促进宫颈癌细胞的增殖,提示FHL2可能作为癌基因起作用。3.FHL2对宫颈癌细胞发挥凋亡与增殖调节作用的可能信号通路为AKT/mTOR。第三部分:下调FHL2表达对裸鼠成瘤作用的影响研究目的1.培养FHL2shRNA转染的宫颈癌细胞系,构建异种移植的裸鼠模型,观察FHL2抑制对裸鼠成瘤作用的影响。2.检测异种移植肿瘤组织中FHL2蛋白的表达水平。研究方法选取FHL2 shRNA转染Hela细胞,同时使用荧光显微镜检和Western blotting检测观察FHL2的表达情况,据此判断转染效果。接着将转染好的Hela细胞通过皮下注射接种到6周龄雌性无胸腺裸鼠的右髂窝中到达指定天数,观察肿瘤的生长趋势,对比两组之间的差别。Western blotting检测FHL2shRNA转染的异种移植肿瘤组织与对照组相比FHL2蛋白表达的情况。研:究结果1.荧光显微镜检和Western blotting结果显示:FHL2 shRNA转染的Hela细胞中FHL2蛋白表达显著降低,转染效果好。2.FHL2shRNA转染的Hela细胞接种至裸鼠后,与对照组相比,肿瘤的生长受到抑制,表现在肿瘤组织的体积和质量较对照组显著减小。3.Western blotting显示:FHL2 shRNA转染的异种移植肿瘤组织中FHL2蛋白表达水平与对照组相比显著降低。研究结论1.Hela细胞中FHL2的表达能被shRNA抑制。2.荷瘤小鼠实验中,下调FHL2能抑制宫颈肿瘤的生长,结合前两部分结论,提示FHL2可能成为临床治疗宫颈癌的靶标。