背景：脑出血是一种常见的脑血管疾病。流行病学调查显示,我国脑出血发病率为(60-80)/10万,占急性脑血管病的18.8-47.6%。在所有的脑血管疾病类型中,脑出血是一类致死率、致残率很高的脑血管疾病,约35-52%的患者在发病后30天内死亡,仅20%的患者在发病六个月后能实现生活自理。近年来,虽然脑出血的基础研究方面取得了很大进步,临床治疗方法也在不断完善,而患者的预后并未得到明显的改善。研究表明,血脑屏障的破坏是脑出血后血管源性脑水肿发生后的一个普遍而重要的病理生理变化。脑出血后脑水肿的发生、发展是导致脑出血患者神经功能严重缺损、脑疝甚至死亡的主要原因之一。脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接、内皮基膜及星形胶质细胞终足构成的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是维持中枢神经系统独特内环境稳态的重要结构,也是中枢神经系统赖以进行各种正常生理活动的前提和基础。而内皮细胞及其间紧密连接是这一结构的关键所在。研究表明,紧密连接(tightjunction,TJ)在结构上是由一组蛋白分子元件所构成的复合体。这些分子元件包括：跨膜蛋白(occludins, claudins, junction associated molecules (JAM)等)和胞浆附属蛋白(zonula occludens (ZO)等)构成。这些紧密连接分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、进而形成稳定的细胞间紧密连接。在众多BBB紧密连接分子元件中,claudins是紧密连接蛋白分子元件的主要构成成分,参与维持紧密连接的选择通透性和细胞极化。Claudin-5是脑微血管内皮细胞紧密连接中的特异性蛋白。Ohtsuki等通过培养大鼠脑微血管内皮细胞发现,claudin-5的外源性表达可诱导BBB的形成。这些研究表明,claudin-5是形成BBB紧密连接的重要分子元件之一。ZO-1是第一个被证实的紧密连接附着蛋白,属于膜相关鸟苷酸激酶样蛋白(MAGUK)家族,主要由PDZ结构域、SH3(Src同源3)结构域和鸟苷酸激酶(GUK)结构域所构成。其中ZO-1可维持上皮细胞极性、间接参与细胞骨架的形成,是细胞紧密连接的重要组成蛋白之一。另外,ZO-1还可参与屏障作用的信号传导、癌细胞的转移等作用。各种因素引起BBB结构和功能破坏是导致脑出血后血管源性脑水肿发生、发展的主要原因。李兵等通过向大鼠脑内注入自体血后发现紧密连接蛋白occludin表达下降,同时出现BBB通透性升高。脑出血发生后,炎性因子、血红蛋白分解产物、凝血酶、氧化应激、补体和基质金属蛋白酶等因素均可导致BBB的破坏。血红蛋白(hemoglobin,Hb)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质,是血液中红细胞的主要成分。人体内的Hb由两个a亚基及两个β亚基构成,每个亚基由一条珠蛋白及一个血红素分子构成。脑出血时,血液通过破裂的血管进入脑内后形成血肿,Hb是血肿主要构成成分之一,主要由大量红细胞崩解释放。研究表明,脑出血后红细胞崩解释放的Hb是导致脑出血后血管源性脑水肿发生发展的主要因素之一。Xi等向大鼠脑内注入完整红细胞3d后出现BBB通透性增加及脑水肿形成,而注入裂解的红细胞后发现,24h内即有BBB通透性显著增加和脑水肿显著形成。这一研究提示脑出血后完整的红细胞不会引起脑水肿的发生,而红细胞崩解后释放的Hb可能参与了脑出血后脑水肿的发生、发展过程。Randal等在对Hb携氧载体等研究过程中发现,Hb作用于体外培养的牛肺血管内皮细胞后,短时间内即可诱导内皮细胞肌动蛋白应力纤维的产生及细胞间隙的形成并可增加牛肺血管内皮细胞的通透性。Silva等研究证据表明,Hb氧化后可以作为炎症介质进而诱导内皮细胞出现细胞骨架改变等炎症反应表现。这些研究表明,Hb可以直接作用于内皮细胞进而诱导紧密连接的破坏及通透性增加。Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,普遍表达在各种组织中,有两种基本亚型(Rho激酶I和Rho激酶II),其中Rho激酶II在脑中表达很高。Rho激酶底物包括肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase)、肌球蛋白、ERM(ezrin/radaxin/moesin)、LIM激酶和cofilin各种因素致使Rho激酶活化后可介导肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)发生磷酸化而引起多种生物学效应,例如血管平滑肌细胞收缩、细胞粘附与迁移、应力纤维的形成、细胞骨架重组等。因此,Rho激酶被多种因素活化后可以介导MLC发生磷酸化修饰而引起多种生物学效应。MLC由基础性轻链和调节性轻链所构成。目前认为,肌球蛋白主要调控细胞骨架并且参与细胞多种生理活动,这些作用主要与肌球蛋白轻链磷酸化和去磷酸化有关。肌球蛋白轻链磷酸化(phosphorylated myosin light chain, p-MLC)受肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)双重调控,共同调节MLC磷酸化和非磷酸化间的动态平衡。MLCK被上游钙-钙调蛋白复合体激活后,引起p-MLC增加。MLCP进行磷酸化修饰后致使自身失活,失活的MLCP不能将MLC脱磷酸化,进而导致p-MLC表达水平增高。以上研究表明,各种因素通过不同信号通路引起细胞内p-MLC表达改变,进而调控细胞各种病理生理过程。脑出血后Hb的释放是引起BBB紧密连接破坏的主要病理介质之一。然而,脑出血后Hb对BBB内皮细胞Rho激酶的影响目前尚少见报道。因此,本研究体内实验通过向SD大鼠脑内注入Hb,动态检测BBB内皮细胞Rho激酶II、磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain, p-MLC)和TJ蛋白claudin-5的表达变化。体外研究通过体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)株,分别加入不同终浓度Hb,在不同的时间观察单层内皮细胞通透性变化、紧密连接蛋白ZO-1、肌动蛋白F-actin及p-MLC的表达变化。通过体内外实验进一步探讨脑出血后探讨Hb导致紧密连接破坏的病理生理机制,阐述脑水肿的发生、发展机制,为今后的治疗提供新的理论依据。目的：本研究体外实验通过体外培养HUVEC细胞株,分别加入终浓度为5umol/L、20umol/L及40umol/L的Hb,分别在3h、6h及12h时,检测单层内皮细胞通透性、p-MLC、肌动蛋白F-actin及TJ蛋白ZO-1表达变化。体内实验通过向SD大鼠脑内注入Hb,动态检测BBB内皮细胞Rho激酶Ⅱ、p-MLC和TJ蛋白claudin-5的表达变化。为进一步探讨Hb引起BBB紧密连接破坏提供理论基础,从而阐述Hb导致BBB紧密连接破坏的分子基础及其病理生理意义。方法：1.通过普通倒置显微镜观察HUVEC细胞株生长增殖过程并且绘制细胞生长增殖曲线。通过免疫组织化学方法第ⅤⅢ因子鉴定该细胞。2.通过检测Transwell外池FITC-葡聚糖的量,判断Hb对单层内皮细胞通透性变化。按照Hb终浓度分别为5umol/L、20umol/L及40umol/L作用于Transwell内池单层HUVEC,分别在3h、6h及12h检测Transwell外池FITC-葡聚糖含量变化；以不加Hb为对照组。3.采用免疫荧光法观察TJ蛋白ZO-1及纤维状肌动蛋白F-actin的表达变化。Hb终浓度分别为5umol/L、20umol/L及40umol/L作用于单层内皮细胞6h时观察TJ蛋白ZO-1及肌动蛋白F-actin的表达变化；4.采用Western Blot方法检测TJ蛋白ZO-1表达变化。Hb终浓度分别为5umol/L、20umol/L及40umol/L作用于单层内皮细胞6h,以不加Hb为对照组,检测TJ蛋白ZO-1的表达变化；5.通过Western Blot方法检测MLC及p-MLC的表达变化。采用Hb终浓度20umol/L作用于内皮细胞,分别在1h、3h、6h及12h时检测MLC及p-MLC的表达变化；6.大鼠按照随机数字法分成正常对照组和Hb组,其中Hb组根据模型制作成功后不同处死时间又分为24h组、48h组、3d组和7d组四个亚组。通过向SD大鼠脑内注入Hb建立脑出血模型。通过免疫组化方法检测血肿周围Rho激酶Ⅱ、p-MLC表达变化,伊文思蓝方法检测BBB通透性的变化,免疫荧光法和mRNA检测BBB紧密连接蛋白claudin-5的表达变化。7.统计学方法：数据均以均数±标准差(x±S)表示,采用SPSS19.0统计软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),若方差齐则采用F检验；方差不齐采用近似F检验Brown-Forsythe法,组间多重比较采用Tamhane’s T2法,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果：1.通过普通倒置显微镜下观察细胞形态学变化及细胞消化计数并且绘制细胞生长和增殖曲线：细胞消化、重悬、接种后6h已完全贴壁；细胞生长至第一天时,细胞完全贴壁伸展,呈圆形、三角形、多角形、不规则形；细胞生长至第二天时,细胞处于静止期,即无细胞增值；生长至第三天时,细胞增殖明显增多,细胞体积增大,胞浆丰富,可见到2个或者多个细胞核,细胞密度可达到80%以上；细胞生长至第四天时,细胞密度进一步增多,细胞体积变小,无明显细胞间隙,外观呈典型的铺路石样,细胞密度可达到95-100%；细胞生长至第五天时,细胞密度增多不明显,外观和第四天较为相似。2.细胞免疫组织化学方法鉴定HUVEC细胞株为第Ⅷ因子大量表达,细胞浆内呈棕黄色或者棕色颗粒,具备典型的内皮细胞特点,PBS阴性对照无DAB显色。3.通过检测Transwell外池FITC-葡聚糖含量评价单层内皮细胞通透性的变化。对照组相对通透性为1.017+0.100;5umol/L在3h为1.107+0.111、6h为1.200+0.221及12h为1.977+0.140;20umol/L在3h、6h及12h分别为1.357+0.076、3.343+0.153、4.983+0.230；而40umol/L在3h、6h及12h分别为1.528+0.698、4.480+0.178及6.670+0.481。与对照组相比,5umol/L作用于12h时FITC-葡聚糖含量开始升高,20umol/L在6h时明显升高,而40umol/L3h时FITC-葡聚糖明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明,Hb作用单层内皮细胞呈现时间和浓度依赖效应。4.细胞免疫荧光法观察细胞间TJ蛋白ZO-1及肌动蛋白F-actin的表达变化：对照组单层内皮细胞间TJ蛋白ZO-1主要分布于细胞近胞膜处,排列连续紧密,边缘光滑,显示出内皮细胞典型的铺路石样外观,细胞间连接紧密,无明显间隙。不同浓度的Hb作用于单层内皮细胞6h时主要表现：与对照组相比,Hb终浓度为5umol/L时,细胞间TJ蛋白ZO-1变化不明显；Hb终浓度为20umol/L时,细胞间TJ蛋白ZO-1表达减少且断裂,细胞间隙增大；Hb终浓度为40umol/L时,ZO-1表达明显减少,环形结构断裂,甚至崩解,周围呈锯齿状外观。对照组内皮细胞F-actin主要分布在细胞周围、细胞连接处较为密集,胞内较少；Hb终浓度为20umol/L作用6h时,F-actin主要分布在细胞内,应力纤维变粗并且增多；Hb终浓度为40umol/L作用于6h时,F-actin主要分布在细胞内,增粗排列紊乱,细胞收缩。5.通过Western Blot方法检测TJ蛋白ZO-1表达变化。采用ZO-1/β-actin之比作为判断TJ蛋白ZO-1的表达量。不同终浓度Hb作用于单层内皮细胞6h时TJ蛋白ZO-1表达变化：Hb终浓度为5umol/L时,TJ蛋白ZO-1表达变化不明显,与对照组比较,差异无统计学意义。当Hb终浓度为20umol/L及40umol/L时,TJ蛋白ZO-1表达明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结果说明,随着Hb浓度增高,TJ蛋白ZO-1表达逐渐降低。6.通过Western Blot方法检测p-MLC及MLC的表达变化。采用p-MLC/MLC之比作为判断细胞内p-MLC的表达量。Hb终浓度为20umol/L分别作用于单层内皮细胞1h、3h、6h及12h时p-MLC的表达变化：MLC表达无明显变化,而Hb作用于单层内皮细胞1h时p-MLC表达量无明显变化,与对照组相比,差异无统计学意义；Hb终浓度为20umol/L作用于3h时p-MLC表达量开始增加,随着时间推移,表达量逐渐增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。7.通过大鼠脑组织免疫组化染色观察Rho激酶II及p-MLC表达变化结果：Rho激酶II表达变化结果：在正常对照组脑组织中,BBB内皮细胞未见Rho激酶II的表达；Hb组24h时在血肿侧BBB内皮细胞上可见少量的棕色颗粒；48h及3d时可见Rho激酶Ⅱ表达明显增多,主要表达在血肿侧BBB内皮细胞上,呈棕色或者棕黄色颗粒；随着时间推移,7d时Rho激酶II表达逐渐降低。p-MLC表达变化结果显示：在正常对照组脑组织中,BBB内皮细胞p-MLC表达较少,主要在血管周围呈低水平棕色线条状分布；Hb组24h时p-MLC有少量表达,48h及3d时血肿侧BBB内皮细胞p-MLC表达明显增强,呈棕黄色线条状分布变化；7d后表达明显减少。8.通过应用伊文思蓝渗透性实验评估Hb对BBB通透性的影响。正常对照组大鼠脑内伊文思蓝含量为2.99±1.45(ug/g), Hb组24h、48h、3d及7d时分别为8.91±2.11、7.26±2.18、11.57±3.13、6.55±1.07(ug/g)。与正常对照组相比,Hb组24h、48h、3d及7d时脑组织伊文思蓝含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。9.通过组织免疫荧光法和实时定量mRNA法检测BBB紧密连接蛋白claudin-5表达变化：免疫荧光法结果示：正常对照组大鼠TJ蛋白claudin-5在BBB内皮细胞间表达强烈清晰,呈连续条带状分布。Hb组24h时血肿周围BBB内皮细胞TJ蛋白claudin-5表达降低,48h及3d时表达达到最低,7d时逐渐恢复。BBB紧密连接蛋白claudin-5mRNA相对表达量结果显示：正常对照组为1.09±0.15,Hb组24h、48h、3d及7d时分别为0.26±0.13、0.31±0.08、0.21±0.04、0.19±0.09；与正常对照组相比,Hb组24h、48h、3d及7d时BBB紧密连接蛋白claudin-5mRNA表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：1.Hb可引起内皮细胞间TJ破坏及通透性增加,进而导致内皮“屏障”功能障碍。2.Hb可引起细胞内p-MLC表达增加,进而导致细胞内F-actin大量应力纤维形成、并诱导细胞间TJ蛋白ZO-1表达下降,这一变化可能是内皮细胞间紧密连接破坏的重要病理生理机制之一。3.Hb可使大鼠脑组织血肿周边Rho激酶Ⅱ表达增加,一方面可引起p-MLC表达增强,紧密连接破坏致使BBB的通透性增加；另一方面可以直接对紧密连接蛋白claudin-5磷酸化修饰而致其表达降低、BBB破坏。这一通路变化可能是导致脑出血后血管源性脑水肿发生、发展的重要机制之一。