乙酰羟酸合酶（AHAS）属于硫胺素焦磷酸（ThDP）依赖酶家族,它是支链氨基酸合成途径中的第一个酶。AHAS既可以识别两分子的丙酮酸合成2-乙酰乳酸（AL）,又可以识别一分子丙酮酸和一分子2-酮丁酸合成2-乙酰基-2-羟基丁酸（AHB）。AL和AHB分别是合成L-缬氨酸和L-异亮氨酸的重要前体。L-缬氨酸和L-异亮氨酸是人体必需氨基酸,可应用于食品、医药等领域。在肠道杆菌中,例如大肠杆菌（Escherichia coli）,AHAS具有多个同工酶（AHAS I、II、III）,同工酶可以相对高效专一的合成L-缬氨酸或L-异亮氨酸,而谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）中只有一个AHAS,由ilvBN基因编码。为了研究AHAS在L-缬氨酸合成中的重要作用,本文利用生物信息学分析了AHAS在细菌中的分布规律和进化树模型等,提出了AHAS的进化模型。探究来源不同C.glutamicum（L-异亮氨酸积累菌株IWJ001和L-缬氨酸积累菌株VWB-1）的IlvBN-I和IlvBN-V合成L-缬氨酸的差异及影响因素。通过定点突变,研究了AHAS突变体对合成L-缬氨酸的影响,并且结合代谢工程的策略,改造C.glutamicum,提高其L-缬氨酸合成能力。主要的研究结论如下:（1）通过生物信息学分析,提出了AHAS的进化模型。从蛋白质序列、进化树模型、蛋白质结构、代谢途径相关基因在基因组中的分布以及合成L-缬氨酸能力的角度,比较了参与支链氨基酸合成的AHAS和参与分解代谢的乙酰乳酸合酶（CALS）的异同。在进化过程中CALS比AHAS出现晚,两者氨基酸序列以及蛋白质结构差异比较大,推断两者并非直接起源于同一祖先,只是ThDP-依赖酶酶家族中的功能类似酶。单一的AHAS在细菌中分布比同工酶高,与同工酶AHAS III亲缘关系相近。在同工酶中,同工酶AHAS III出现最早,而同工酶AHAS I出现最晚,同工酶AHAS II和AHAS I出现的原因是γ-Proteobacteria菌株分化和基因重排。并提出早期支链氨基酸合成途径基因在基因组中无规律分布,随着菌株的进化分化,支链氨基酸合成途径基因逐渐形成基因簇,更高效的催化特定氨基酸的合成。（2）通过定点突变,发现C.glutamicum IlvBN第138个氨基酸的突变影响L-缬氨酸的合成。来源于IWJ001的IlvBN-I(IlvBN^138A404V)和来源于VWB-1的IlvBN-V(IlvBN^138V404A)的调节亚基蛋白质序列完全相同,两者催化亚基的第138个氨基酸和第404个氨基酸不同。在ATCC14067中过表达IlvBN^138V404V突变体,合成L-缬氨酸9.06g·L^-1,相较于过表达IlvBN-I提高50%;在ATCC14067过表达IlvBN^138A404A突变体,合成L-缬氨酸5.17 g·L^-1,相较于过表达IlvBN-V降低42.5%。本文首次发现IlvBN第138个氨基酸突变为缬氨酸有利于合成L-缬氨酸,第404个氨基酸的突变不影响合成L-缬氨酸。体外酶活检测发现,IlvBN-V酶促反应最适pH值相较于IlvBN-I低,更适合在低pH值下催化酶促反应。在IWJ001和IWJ001的敲除菌株中过表达IlvBN-V均能高效的合成L-缬氨酸。（3）通过蛋白结构模拟和分子生物学的方法,解析同工酶AHAS I,II,III高度保守的氨基酸对L-缬氨酸合成的影响。IlvBN定点突变研究表明,同工酶AHAS I,II,III分别高度保守并且保守氨基酸不同的位点与酶催化活性相关,点突变IlvBN^H78F、IlvBN^A79I和IlvBN^M499L会降低IlvBN合成L-缬氨酸的能力。同工酶AHAS III中部分保守,对应位点在同工酶AHAS I和AHAS II中高度保守并且保守氨基酸不同的位点,与特异性合成L-缬氨酸或L-异亮氨酸相关。IlvBN的第47个氨基酸位于高度保守的“G-PGG”区域,在同工酶AHAS I为保守的异亮氨酸（I）,在AHAS II中为保守的酪氨酸（Y）,在IWJ001中过表达IlvBN-I^I47Y突变体,相较于过表达IlvBN-I,L-缬氨酸降低62.0%,合成L-异亮氨酸提高12%,说明第47个氨基酸的突变影响重组菌株合成L-缬氨酸和L-异亮氨酸的偏好性。IlvBN的第47个氨基酸为异亮氨酸（I）,对L-缬氨酸合成起重要作用。（4）本研究通过在课题组前期构建的敲除菌株ATCC14067△aceE△ilvA△alr△leuA（YTW-104）的基础上,高效表达适合L-缬氨酸合成的IlvBN以及其他L-缬氨酸合成途径基因,从敲除菌株YTW-104出发,构建L-缬氨酸生产菌。使用适合于L-缬氨酸积累的发酵培养基,摇瓶发酵YTW-104合成L-缬氨酸9.32 g·L^-1。在YTW-104中过表达ilvBN^A138V基因,L-缬氨酸合成增加。摇瓶发酵84 h时,重组菌株YTW-104/pJYW-4-ilvBN^A138VC-ilvE合成L-缬氨酸产量最高,合成L-缬氨酸25.93 g·L^-1,糖酸转化率为0.489g·g^-1。