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干细胞具有很强的自我更新和分化的能力,在特定环境中可以定向分化为有功能的细胞。国内外的研究已经证实了干细胞在治疗器官损伤及细胞再生中能够发挥很独特的作用,干细胞的研究已广泛涉足到血液系统、骨骼系统、神经系统、心血管系统、消化系统等领域。成体干细胞包括造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。造血干细胞已经在血液疾病的治疗中发挥了很好的疗效,为研究者们对干细胞在再生医学的研究增强了信心,给许多疾病的治愈带来了新的希望。间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、脐血等组织。其中骨髓间充质干细胞作为人体中的一种成体干细胞,数量多,获取方法简单,抽取过程及抽取完后对身体影响较小,逐渐被学者们和临床医生所重视。在特定的环境中,骨髓间充质干细胞可以分化为各种成体细胞,促进损伤器官的修复,改善器官的功能。在肝损伤的修复中,干细胞可以转分化为肝细胞,分泌白蛋白,促进肝脏的修复,并改善肝脏功能。国内外基础及临床研究,已经证实了骨髓间充质干细胞移植对肝硬化、肝衰竭等疾病具有明确的治疗作用。目前,在我国、日本、欧洲等国相继已经开展了自体骨髓间充质干细胞对肝硬化的临床治疗,疗效确切,目前暂未发现明显副作用的报道。在临床运用中,有关学者及医生提出了关于移植途径的问题,常见有三种移植方式治疗终末期肝病,分别是门静脉途径、肝动脉途径、外周静脉途径,到底哪种途径移植干细胞的疗效更好呢?然而,关于这方面的报道较少,为此我们拟进行该问题的研究,阐明这三种移植途径是否对肝硬化治疗的疗效有影响。为了模拟临床中的干细胞移植治疗肝硬化的特征,我们建立了大鼠肝硬化模型,并培养大鼠骨髓MSCs,通过常用的三种途径将骨髓MSCs移植到模型大鼠体内,移植后4周观察比较这三种途径移植骨髓MSCs对肝硬化模型大鼠的疗效差别,为临床应用提供参考。研究方法:1、购SD雌性大鼠,58只,200~230g,利用四氯化碳液体橄榄油混合液皮下注射和酒精喂养的方法,并逐渐增加四氯化碳和酒精的浓度,建立肝硬化大鼠模型。2月后将存活下来的肝硬化模型大鼠随机分为肝硬化未移植组(n=8)、门静脉移植组(n=8)、肝动脉移植组(n=8)、尾静脉移植组(n=8)。2、取健康SD大鼠骨髓,利用全骨髓贴壁的方法原代培养骨髓MSCs。3、取第3代骨髓MSCs,利用CM-DiI标记MSCs。4、分别通过门静脉途径、肝动脉途径、尾静脉途径将标记好的MSCs移植到肝硬化模型大鼠体内。5、移植后4周取肝组织行冰冻切片,Hoechst染核,激光共聚焦显微镜观察干细胞在肝脏的分布及数量。6、取肝组织行HE和Masson染色,观察肝硬化程度。7、检测血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、直接胆红素、间接胆红素、Ⅳ型胶原等指标。研究结果1、激光共聚焦显微镜观察MSCs在肝内分布情况计数每个视野下定植于肝组织中MSCs数量,三种移植途径分别为:门静脉移植组22.80±2.12,肝动脉移植组25.04±2.36,尾静脉移植组23.36±4.07,无统计学差异(P>0.05),提示三种途径移植MSCs,经过4周后定植在肝脏的MSCs的数量无明显差异。2、肝脏大体形态改变及病理学检查结果(1) MSCs移植后4周,观察肝脏大体标本外观,见不同途径移植组的大鼠肝硬化程度均有所减轻;肝硬化未移植组的组织学仍呈现典型肝硬化改变。(2) HE染色见移植后各组大鼠肝脏切片内肝细胞变性、坏死有所减轻,肝细胞索较规则,小叶结构稍变清晰,汇管区炎细胞浸润减轻。(3) Masson染色见移植后各组大鼠肝脏假小叶数量减少,肝组织内纤维束减少、变细。但三种不同途径移植组的肝脏病理学改善程度无显著区别。(4)根据Masson染色结果,按照Chevallier肝纤维化组织学半定量计分系统(SSS)评分,肝硬化未移植组:21.35±2.16,门静脉移植组:11.48±1.66,肝动脉移植组:11.46±1.02,尾静脉移植组:10.75±0.90,统计结果表明三种途径移植MSCs后的大鼠肝脏的纤维组织较未进行MSCs移植的肝硬化大鼠明显减少(P<0.05);但三种途径移植MSCs后的大鼠肝纤维化程度之间无显著差异(P>0.05)。上述结果提示移植后,肝细胞损伤减轻,肝硬化程度有所改善,但三种不同途径移植组间改善程度无明显差异。3、血清学检查结果通过三种途径移植MSCs到肝硬化模型大鼠体内,4周后发现移植组模型大鼠的肝功能均得到明显改善,血清白蛋白较肝硬化未移植组显著升高(P<0.05),转氨酶、胆红素较肝硬化未移植组显著降低(P<0.05),Ⅳ型胶原较肝硬化未移植组显著降低(P<0.05)。结论1、骨髓MSCs移植治疗模型大鼠肝硬化,移植后4周肝纤维化程度降低,肝功能改善;2、MSCs通过三种方法移植至肝硬化模型大鼠体内,4周后均能见到肝脏内有明显干细胞定植,并且三种移植方法定植于肝脏的MSCs数量无统计学差异;3、三种方法移植干细胞治疗模型大鼠肝硬化均有效,且效果相似。