一、研究目的三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer,TNBC）仍然是亟待解决的医学挑战之一,如何选择有效、无副作用和不易产生获得性耐药的药物是困扰抗肿瘤治疗的瓶颈问题。分子靶点挖掘及对应靶向药物的开发对于早期诊断并有效治疗三阴性乳腺癌具有重要意义。凋亡抵抗和代谢异常是癌症的常见特征,均与线粒体途径密切相关。除具有上述两大特征外,三阴性乳腺癌通常还伴随PI3K/AKT/mTOR通路的异常活化。三黄煎剂（Sanhuang Decotion,SHD）是江苏省名中医许芝银教授治疗乳腺癌的经验方,前期研究证实其可显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性,但具体作用机制仍需探讨并验证。为了揭示三黄煎剂治疗三阴性乳腺癌的作用机制,我们开展了本研究。二、研究方法1.动物实验1)三黄煎剂干预对三阴性乳腺癌细胞荷瘤小鼠的影响:挑选5周龄BALB/c-nu裸鼠25只,测量体重并适应性喂养一周。左腋窝皮下接种MDA-MB-231细胞后将其随机分为空白对照组（CON）、模型组（Model）、三黄煎剂高剂量组（SHD-H）、三黄煎剂中剂量组（SHD-M）、三黄煎剂低剂量组（SHD-L）共5个组别。造模成功后予生理盐水及三黄煎剂灌胃。干预3周后测量各组小鼠体重、瘤重等相关指标,采用HE染色观察各组小鼠肝肾病理情况。2)三黄煎剂干预对各组小鼠肿瘤组织PI3K/AKT/mTOR通路相关基因转录水平的影响:实时荧光PCR检测PI3K/AKT/mTOR通路相关基因转录水平。3)三黄煎剂干预对各组小鼠肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响:免疫组化（IHC）检测凋亡相关表型蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3表达水平;TUNCEL染色法观察肿瘤细胞凋亡情况。2.体外实验1)三黄煎剂干预对MDA-MB-231细胞生存和增殖的影响:MTT法检测三黄煎剂对MDA-MB-231细胞生存率的抑制作用;克隆形成实验检测三黄煎剂对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用。2)三黄煎剂干预对MDA-MB-231细胞PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达的影响:蛋白质免疫印迹法（WB）及免疫荧光（IF）检测PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达。3)三黄煎剂干预对MDA-MB-231细胞凋亡及线粒体内蛋白表达的影响:Annexin V/7-ADD染色法结合流式细胞术检测三黄煎剂干预后细胞凋亡情况;蛋白质免疫印迹法（WB）和免疫荧光（IF）检测凋亡发生表型蛋白（Cleaved-caspase-3/9）和Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax、Mcl-1）的表达。蛋白质免疫印迹法（WB）检测三黄煎剂干预后线粒体内Mcl-1和Bak表达水平变化。4)三黄煎剂干预影响了线粒体功能:运用JC-1染色法结合流式细胞术检测线粒体膜电位变化。5)三黄煎剂通过调节Mcl-1含量影响线粒体功能诱发凋亡抑制细胞生存:采用质粒转染过表达Mcl-1,观察比较三黄煎剂干预下野生型组和过表达组的生存抑制作用。荧光显微镜及蛋白质免疫印迹法（WB）观察并确认转染效率。6)三黄煎剂干预对MDA-MB-231细胞Mcl-1转录水平的影响:实时荧光PCR法检测三黄煎剂干预下Mcl-1基因的转录水平。7)三黄煎剂干预对MDA-MB-231细胞自噬流量的影响:蛋白质免疫印迹法（WB）检测三黄煎剂干预下MDA-MB-231细胞自噬流量的变化。8)三黄煎剂干预下自噬流量增强对Mcl-1含量水平的影响:运用自噬抑制剂干预自噬过程后,蛋白质免疫印迹法（WB）检测三黄煎剂干预下Mcl-1及p62表达变化。9)三黄煎剂干预对Mcl-1和p62蛋白复合物结合作用的影响:免疫荧光（IF）共定位、免疫共沉淀（CO-IP）结合蛋白质免疫印迹法（WB）法检测三黄煎剂干预对Mcl-1和p62复合物结合作用的影响。10)三黄煎剂干预对p62 S403位点磷酸化的影响。蛋白质免疫印迹法（WB）检测三黄煎剂干预后p62 S403位点的磷酸化水平是否升高。3.处方挖掘运用CNKI、VIP和Wanfang等中文数据库对中医药口服治疗三阴性乳腺癌的相关文献进行检索。按照纳排标准筛选后,通过中医传承辅助平台软件对筛选出的文献进行挖掘分析,结合频次统计、聚类分析等统计方法,研究三阴性乳腺癌中医治疗中的用药共性及特色。为三黄煎剂治疗三阴性乳腺癌临证用药提供参考。4.数据挖掘运用网络药理学对三黄煎剂作用靶点的预测研究发现,其可能作用靶点与细胞膜表面受体通路相关。G蛋白偶联受体（GPCR）是数量最大、种类最多的膜表面受体。RGS蛋白家族是GPCR的调节剂。目前RGSs在乳腺癌中的研究较少,我们对RGS家族蛋白的泛表达及其与乳腺癌临床病理特征的相关性进行探讨,希望在此基础上对三黄煎剂的机制探讨及开发新的预后模型起到一定帮助。三、研究结果1.动物实验1)三黄煎剂干预可以抑制瘤体生长,且无肝肾毒性:三黄煎剂干预3周后发现,干预组瘤体较对照组减小;HE染色法检测发现干预组肝肾组织无异常病理表现,证明三黄煎剂无肝肾毒性;2)三黄煎剂干预抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关基因转录水平:实时荧光PCR检测发现,中、高剂量三黄干预组肿瘤组织中PI3K/AKT/mTOR通路相关基因转录水平受到抑制;3)三黄煎剂干预诱导肿瘤细胞发生凋亡,肿瘤组织出现坏死:IHC法检测发现Bax、Cleaved-caspase-3表达升高,Bcl-2表达降低;TUNEL染色法发现三黄煎剂干预诱导肿瘤细胞凋亡呈剂量依赖性增强。2.体外实验1)三黄煎剂干预后显著抑制MDA-MB-231细胞生存和增殖:MTT法检测发现干预组细胞生存及增殖较对照组受到明显抑制;2)三黄煎剂干预后抑制MDA-MB-231细胞PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达:WB及IF发现干预组PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达水平降低;3)三黄煎剂诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡并影响线粒体内相关蛋白表达:Annexin V/7-ADD染色法结合流式细胞术检测发现,干预组细胞凋亡明显增加;WB及IF发现干预组Caspase凋亡级联反应相关蛋白表达升高,Bcl-2、Mcl-1等抗凋亡蛋白表达降低,Bax等促凋亡基因的表达升高;WB检测线粒体蛋白发现干预组线粒体中Bak/Mcl-1 比例增加,证实三黄煎剂干预影响了线粒体Bak和Mcl-1蛋白表达;4)三黄煎剂干预影响了线粒体功能:JC-1染色法结合流式细胞术检测线粒体膜电位,发现干预组J-Monomer明显提高,证实三黄煎剂干预后,线粒体功能发生了改变;5)Mcl-1含量与三黄煎剂对肿瘤细胞的生存抑制作用有关。WB和荧光显微镜观察确认过表达Mcl-1转染成功;MTT法检测结果表明,三黄煎剂对过表达组肿瘤细胞生存抑制作用明显降低;6)三黄煎剂干预没有造成Mcl-1转录水平降低:实时荧光PCR检测发现干预组Mcl-1的转录水平较对照组无明显变化;7)三黄煎剂干预诱导自噬流量增加:WB检测发现干预组自噬相关蛋白p62和LC3A/B表达增加,但p62蛋白水平随时间进展降低;8)三黄煎剂干预增强细胞自噬流量导致Mcl-1含量降低:CQ阻断抑制自噬体与溶酶体的融合过程后,WB检测发现抑制剂联合三黄煎剂干预组Mcl-1含量较三黄煎剂干预组升高。9)三黄煎剂干预增强Mcl-1和p62的结合作用:IF共定位、CO-IP结合WB检测发现,Mcl-1和p62存在结合作用,且三黄煎剂可以增强这一作用;10)三黄煎剂干预增强p62 S403位点的磷酸化:WB检测发现干预组p62 S403磷酸化水平较对照组升高。四、结论1)三黄煎剂通过调控PI3K/AKT/mTOR通路抑制三阴性乳腺癌瘤体生长,并通过诱发肿瘤细胞凋亡造成肿瘤组织坏死;2)三黄煎剂可以有效抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性,促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 凋亡;3)三黄煎剂抑制肿瘤细胞PI3K/AKT/mTOR通路活性并增强其自噬流量。同时,三黄煎剂促进p62 S403位点磷酸化,增强p62介导的选择性自噬,降解自噬底物Mcl-1。Mcl-1含量降低使线粒体外膜通透性发生改变,诱发肿瘤细胞线粒体途径凋亡。4)通过对中医药治疗TNBC相关文献研究,总结出以下几类方以辅助三黄煎剂临证加减:①以四君子汤加减为核心组方,针对脾虚痰阻证患者;②以“癌三味”白花蛇舌草、半枝莲和山慈菇的抑癌药物组方,主要用于抑制癌症进展;③以女贞子、墨旱莲等为核心组方,针对冲任失调的患者;④以柴胡、白芍为核心组方,适用于情志不畅、肝气郁滞的患者。5)通过对GEO等数据库的挖掘和分析后,利用lasso回归构建了一个包含RGS1、RGS2、RGS3、RGS9、RGS17、RGS20和ARHGEF1等7个RGS家族基因组成的风险得分模型。对模型进行预后效能及稳健性评估,结果均表明该模型可以作为一个有效的预后指示指标。此外,该模型与免疫浸润相关性及GSEA分析均表明该模型可能是通过免疫角度来影响肿瘤的发展。这对三黄煎剂作用机制的后续研究提供了新思路和新依据。