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目的:对于种植材料而言,具有骨结构仿生特点的微/纳米分级表面形貌具有更好的生物活性,能够促进细胞的成骨向分化,抑制其成脂向分化,有利于种植体表面新骨形成。然而,细胞对微/纳米分级表面形貌的机械响应过程和潜在的应答机制目前并不清楚。本研究的目的在于探讨机械信号响应分子TAZ在该过程中的作用及其活化机制。对该问题的深入探讨,有助于理解种植体表面微/纳米分级形貌对细胞生物学行为的调控作用,并为针对性开展种植材料表面改性提供线索和思路。方法:1.探究TAZ在微米沟槽/纳米网孔分级形貌钛表面调控干细胞分化过程中的作用。采用选择性激光熔融(selective laser melting fully melting,SLM)技术结合碱热处理(alkali-heat treatment,AHT)制备具有微米沟槽/纳米网孔结构的分级形貌的种植用钛表面(SLM-AHT),以光滑钛表面(Ti)、喷砂酸蚀钛表面(SLA)为对照表面形貌,应用体外实验评估各组钛表面形貌对牙周膜干细胞(periodontal ligamennt stem cells,PDLSCs)成骨、成脂分化的影响。在Ti、SLA和SLM-AHT钛表面培养PDLSCs并分别进行成骨和成脂诱导,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测各组钛表面细胞培养液中ALP活性;通过实时定量PCR检测成骨相关基因RUNX2和ALP的mRNA表达水平和成脂相关基因PPARγ和CEBP/α的mRNA表达水平;通过免疫荧光和蛋白质印迹法检测成骨相关蛋白RUNX2和成脂相关蛋白PPARγ2的蛋白表达水平。通过免疫荧光染色比较不同形貌钛表面上细胞内TAZ的定位情况;通过实时定量PCR实验比较不同形貌钛表面上TAZ靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达水平。构建慢病毒载体稳转入PDLSCs表达shRNA敲低TAZ,通过对诱导后的在不同形貌钛表面上培养的TAZ-shRNA-PDLSCs(TAZ敲低型PDLSCs)和TAZ-Scramble-PDLSCs(TAZ敲低型PDLSCs的对照组细胞)进行实时定量PCR实验,比较成骨、成脂相关基因的mRNA表达变化情况,验证TAZ在微/纳米分级形貌钛表面调控PDLSCs分化中的作用。2.探究TAZ在微米沟槽/纳米网孔分级形貌钛表面调控干细胞分化过程中的活化机制。通过免疫荧光观察PDLSCs在不同形貌钛表面的细胞骨架状态;细胞松弛素D处理后免疫荧光观察TAZ重分布情况;细胞松弛素D处理后实时定量PCR检测TAZ靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达变化情况,证明细胞骨架在微/纳米分级形貌激活TAZ过程中的调控作用。通过蛋白质印迹法检测MAPK通路关键蛋白JNK、ERK和p38在不同形貌钛表面的蛋白表达水平;MAPK抑制剂处理后免疫荧光观察TAZ重分布情况;MAPK抑制剂处理后实时定量PCR检测TAZ靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达变化情况,证明MAPK信号通路在微/纳米分级形貌激活TAZ过程中的调控作用。结果:1.体外成骨成脂诱导的ALP活性检测、实时定量PCR、免疫荧光、蛋白质印迹实验结果表明,与Ti和SLA钛表面相比,SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面细胞培养液中的ALP活性最高,成骨相关基因RUNX2和ALP mRNA表达水平升高,成骨相关蛋白RUNX2阳性染色最强其表达水平也升高;而成脂相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平降低,成脂相关蛋白PPARγ2的表达水平也降低。不同形貌钛表面培养PDLSCs的免疫荧光和实时定量PCR结果表明,SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面较Ti和SlA钛表面TAZ核定位增加,TAZ靶基因CYR61和CTGF的mRNA表达水平升高。TAZ敲低后,实时定量PCR结果表明,与TAZ-Scramble-PDLSCs对照组相比,TAZ-shRNA-PDLSCs组中Ti、SLA和SLM-AHT三组钛表面成骨相关基因RUNX2和ALP mRNA表达水平均降低,成脂相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平均升高,其中SLM-AHT钛表面成骨、成脂相关基因mRNA变化幅度最大,且三组钛表面之间成骨、成脂相关基因表达水平不再具有显著性差异。2.不同形貌钛表面培养PDLSCs的免疫荧光结果表明,与Ti和SLA钛表面相比,SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面PDLSCs细胞骨架F-actin的聚集程度最大,说明SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面更能够促进PDLSCs细胞骨架F-actin的聚集。细胞骨架解聚剂细胞松弛素D处理后的免疫荧光和实时定量PCR结果表明,与对照组相比,加入细胞松弛素D后Ti、SLA和SLM-AHT钛表面TAZ核定位均减少,其中SLM-AHT组减少的更多,且三组之间不再有可观察到的差异,TAZ靶基因CYR61和CTGF mRNA表达水平均下降,其中SLM-AHT组下降的最多,且三组之间TAZ靶基因表达水平不再具有显著性差异,说明细胞松弛素D消除了分级形貌钛表面促进TAZ核易位及激活TAZ的作用,即微/纳米分级形貌引起的细胞骨架聚合是TAZ活化的关键因素之一。MAPK关键蛋白的蛋白质印迹实验结果表明,与Ti和SLA钛表面相比,SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面p-ERK、p-p38蛋白表达水平升高,p-JNK蛋白表达水平无明显变化,说明SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面可以激活ERK、p38 MAPK通路。ERK和p38抑制剂处理后免疫荧光和实时定量PCR结果表明,与对照组相比,加入抑制剂后Ti、SLA和SLM-AHT钛表面TAZ核定位均减少,其中SLM-AHT组减少的更多,且三组之间不再有可观察到的差异,TAZ靶基因CYR61和CTGF mRNA表达水平均下降,其中SLM-AHT组下降的最多,且三组之间TAZ靶基因表达水平不再具有显著性差异,说明ERK和p38抑制剂消除了分级形貌钛表面促进TAZ核易位及激活TAZ的作用,即微/纳米分级形貌引起的ERK、p38MAPK信号通路激活是TAZ活化的关键因素之一。结论:本研究结果表明与Ti和SLA钛表面相比,SLM-AHT微/纳米分级形貌钛表面具有更好的诱导PDLSCs体外成骨分化的能力,该表面可以促进细胞骨架F-actin的聚集,激活MAPK信号通路,从而促进TAZ的核易位、激活TAZ,进而促进PDLSCs成骨分化、抑制其成脂分化。