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核糖体合成非常复杂，需要许多核糖体组装因子(Ribosomal biogenesis factors，RBFs)协助完成。在拟南芥中，通过生物信息学分析鉴定到约75％的酵母同源RBFs，但是目前只有少部分拟南芥同源RBFs得到验证。在酵母细胞中，AAA-ATPaseMidasin1(MDN1)参与60S核糖体大亚基前体(pre-60S)的合成，但是拟南芥MDN1(AtMDN1)在核糖体合成中的分子功能尚待研究。本研究利用多种实验手段对该问题进行了深入探究。
核糖体合成需要占用细胞内大量的基因转录活动和能量，因此核糖体合成不仅能驱动植物细胞生长，而且可能参与植物生长发育的调控。核糖体合成缺陷突变体通常会表现出典型的生长缺陷表型(如主根变短、胚胎发育异常等)，表明植物的生长发育过程可能对核糖体合成过程敏感，并受核糖体合成的调控，但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷调控这些表型形成的分子机理。拟南芥mdn1-1突变体具有主根变短、叶脉发育异常、叶片狭长且有收敛点以及对生长素处理不敏感等生长素缺陷相关表型，还具有种子败育和开花时间提前的表型。为了探究核糖体合成对植物生长发育的调控作用，本研究以mdn1-1突变体为主要材料，系统分析因MDN1突变导致的核糖体合成缺陷与生长素响应、胚胎发育和开花时间调控之间的联系。
拟南芥核糖体蛋白(Ribosomal proteins，RPs)都由多个基因编码，而且同一个RP家族的不同成员可以同时表达并组装至不同的核糖体中。但是，特定RP和包含特定RP的核糖体是否具有特异的功能尚待研究。本研究通过过量表达RPs来提高特定RP的蛋白剂量和包含特定RP核糖体所占比例的方式，对这一问题进行深入研究。
高效的植物胚性愈伤诱导和芽再生体系的建立，是利用转基因的手段进行作物遗传改良的关键。本研究利用糖皮质激素受体-地塞米松(Glucocorticoid Receptor-Dexamethasone，GR-DEX)诱导系统，对共表达胚性转录因子基因LEC2和细胞分裂素合成酶基因IPTs在胚性愈伤诱导和芽再生体系建立中的作用进行了探究。
1.AtMDN1调控60S核糖体合成。AtMDN1在细胞分裂旺盛的组织中表达量高。mdn1-1突变体是单碱基突变突变体，具有明显的表型缺陷但是能够存活;mdn1-2突变体为T-DNA插入突变体，导致MDN1功能缺失，纯合致死。斑点印记杂交实验表明，AtMDN1定位于细胞核，在mdn1-1突变体中，部分AtMDN1出现在细胞质中。观察核糖体大亚基融合蛋白(RPL16D-GFP)和小亚基融合蛋白(RPS13A-GFP)的荧光分布，发现在mdn1-1突变体中pre-60S的核输出异常。检测rRNA前体(pre-rRNA)的积累，发现35S、27SB和20Spre-rRNA在mdn1-1突变体中的积累量增加，表明pre-rRNA主要的加工途径可能被改变。蛋白互作验证表明，AtMDN1与拟南芥中的另外两个酵母RBFs同源蛋白(PESCADILLO2/PES2和NOCHELESS/NLE)相互作用。mdn1-1突变体对放线菌酮(蛋白翻译抑制剂)处理敏感，表明mdn1-1突变体的翻译效率下降。上所述结果表明，拟南芥MDN1参与60S核糖体的合成。
2.核糖体合成与生长素构成反馈调节环调控植物生长发育。核糖体合成缺陷突变体通常表现出生长素缺陷相关表型，但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷与生长素之间的联系。使用生长素响应DR5:GUS和DR5rev:GFP报告株系进行观察，发现mdn1-1突变体子叶、主根和叶片边缘的生长素响应和响应分布异常。使用流式细胞仪对主根进行检测，发现处于G0/G1期的根细胞数量在mdn1-1突变体中显著增加。在mdn1-1突变体中，生长素合成基因(YUC3、YUC5、YUC7、YUC8、YUC9和TAA1)的表达量下降，生长素极性运输载体AUX1和PIN1的蛋白积累量下降，PIN3和PIN7的基因表达量下降，而PIN2的蛋白积累量增加。转录组分析结果表明，mdn1-1突变体主根中生长素合成、信号转导和生长素响应相关基因的表达量下降。在mdn1-1突变体中，根生长调控因子PLT1和PLT2的基因表达量下降，SCR和SHR的蛋白积累量增加。生长素能激活MDN1的表达，酵母单杂交实验显示ARFs可能直接与MDN1启动子结合。在mdn1-1突变体中，MDN1的表达量下降。上述结果表明，核糖体合成与生长素可以形成反馈调节环调控植物的生长发育。
3.AtMDN1调控胚胎发育。mdn1-1突变体果荚变短，成熟种子数量减少且存在败育的种子，表明AtMDN1突变导致胚胎发育异常，但是目前尚不清楚其具体机理。mdn1-2突变体纯合植株致死，在mdn1-2/+杂合突变体的果荚中发现停止发育的胚珠，其胚胎发育停滞在早期球形胚时期，进一步表明AtMDN1可能参与拟南芥早期胚胎发育的调控。观察mdn1-1突变体胚胎发育的过程，发现mdn1-1突变体胚胎发育迟缓，而且在球形胚时期存在4种形态异常的胚胎。AtPES2和AtNLE分别在核仁和核质中与AtMDN1相互作用。拟南芥pes2-1和nle-1突变体分别为AtPES2和AtNLE的T-DNA插入突变体，导致AtPES2和AtNLE功能缺失，纯合植株致死。在杂合突变体pes2-1/+和nle-1/+的果荚中也存在败育的种子，其胚胎同样在早期球形胚时期发育停滞。上述结果表明，AtPES2和AtNLE与AtMDN1类似，也可能在拟南芥早期胚胎发育中发挥重要的作用。球形胚时期胚胎发育异常可能与该时期胚胎的发育需要大量的核糖体来满足快速的细胞分裂对蛋白质的需求有关。利用生长素响应DR5rev:GFP报告株系，发现球形胚时期的生长素稳态和生长素响应在mdn1-1突变体中受到明显影响，表明AtMDN1可能在维持球形胚时期生长素的稳态和生长素响应方面也发挥重要作用。
4.AtMDN1调控拟南芥开花。RP和RBFs突变通常会导致植物生长迟缓和开花延迟，但是目前尚不清楚核糖体突变如何调控开花时间提前。本研究发现，mdn1-1突变体在长日照(LD)和短日照(SD)条件下开花时间提前。转录组分析结果表明，自主途径相关基因和ABI5的基因表达量上调以及FLC的表达量下调可能在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1flk和mdn1-1fve-4双突变体能够抑制mdn1-1突变体的早花表型，表明FLC表达量下降在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1flk和mdn1-1fve-4双突变体能够显著恢复flk和fve-4突变体的晚花表明，表明MDN1突变同时产生了FLC-independent的调控变化。mdn1-1flc-3双突变体开花时间晚于flc-3和mdn1-1突变体，表明FLC在mdn1-1的花期调控中发挥重要的作用，FLC突变后，其它信号途径可能不足以调控mdn1-1的早花表型。mdn1-1abi5双突变体开花时间晚于野生型和mdn1-1，表明ABI5在MDN1突变导致的核糖体合成缺陷对植物花期的调控中发挥重要的作用。mdn1-1clf-28开花时间早于mdn1-1而晚于clf-28，可能与mdn1-1中FT的表达量下降有关，在mdn1-1中提高FT的表达量能进一步促进其开花时间。mdn1-1co和mdn1-1ft-10双突变体抑制mdn1-1突变体的早花表型，表明光周期途径影响mdn1-1的开花时间。
5.RPL16D平衡植物的生长和抗病性。拟南芥过表达RPL16D(L16D-OEs)导致植物在营养生长后期(21DAG开始)叶片卷曲、叶柄变短。莲座叶的转录组和蛋白质组分析结果表明，调控植物生长相关蛋白(如固醇和BR合成、细胞壁合成蛋白)的积累量在L16D-OEs中显著下降;同时，抗病相关基因的表达量和蛋白的积累量显著上调，暗示L16D-OEs的抗病性提高。假单胞杆菌(Pst DC3000)的侵染实验表明L16D-OEs的抗病性显著提高。上述结果显示，过表达RPL16D会减缓植物的生长，同时赋予植物更强的抗病性，表明RPL16D可能在平衡植物生长和植物抗病方面发挥重要作用。因此，通过转基因的方法适量提高RPL16D的蛋白剂量，可能在作物的遗传改良中具有很好的应用前景。
6.创新与应用——创建简单高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系。LEAFYCOTYLEDON2(LEC2)在整个胚胎发育阶段发挥维持细胞胚性特性的作用。我们前期的研究表明，在烟草(N.tabacum)中，通过DEX诱导AtLEC2-GR向细胞核的转运，可以在幼苗茎尖产生胚性愈伤，但是胚性愈伤的芽再生效率较低。细胞分裂素可以诱导芽的再生，因此本研究探究在AtLEC2-GR烟草中过表达拟南芥细胞分裂素合成酶(Isopentenyl Transferase，IPT)基因(AtIPT3、AtIPT7和AtIPT9)对芽再生效率的影响。AtIPT7-OEAtLEC2-GR和AtIPT9-OEAtLEC2-GR幼苗在DEX诱导下可以在茎尖产生胚性愈伤，而且在不含激素的培养基中，芽再生效率分别比AtLEC2-GR提高2倍和3.5倍。本研究利用GR-DEX诱导表达系统，构建了一个高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系，该体系可以不依赖外源激素，在含有DEX的培养基中诱导胚性愈伤的产生，在不含有DEX的培养基中显著提高胚性愈伤的芽再生数量。
核糖体合成需要占用细胞内大量的基因转录活动和能量，因此核糖体合成不仅能驱动植物细胞生长，而且可能参与植物生长发育的调控。核糖体合成缺陷突变体通常会表现出典型的生长缺陷表型(如主根变短、胚胎发育异常等)，表明植物的生长发育过程可能对核糖体合成过程敏感，并受核糖体合成的调控，但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷调控这些表型形成的分子机理。拟南芥mdn1-1突变体具有主根变短、叶脉发育异常、叶片狭长且有收敛点以及对生长素处理不敏感等生长素缺陷相关表型，还具有种子败育和开花时间提前的表型。为了探究核糖体合成对植物生长发育的调控作用，本研究以mdn1-1突变体为主要材料，系统分析因MDN1突变导致的核糖体合成缺陷与生长素响应、胚胎发育和开花时间调控之间的联系。
拟南芥核糖体蛋白(Ribosomal proteins，RPs)都由多个基因编码，而且同一个RP家族的不同成员可以同时表达并组装至不同的核糖体中。但是，特定RP和包含特定RP的核糖体是否具有特异的功能尚待研究。本研究通过过量表达RPs来提高特定RP的蛋白剂量和包含特定RP核糖体所占比例的方式，对这一问题进行深入研究。
高效的植物胚性愈伤诱导和芽再生体系的建立，是利用转基因的手段进行作物遗传改良的关键。本研究利用糖皮质激素受体-地塞米松(Glucocorticoid Receptor-Dexamethasone，GR-DEX)诱导系统，对共表达胚性转录因子基因LEC2和细胞分裂素合成酶基因IPTs在胚性愈伤诱导和芽再生体系建立中的作用进行了探究。
1.AtMDN1调控60S核糖体合成。AtMDN1在细胞分裂旺盛的组织中表达量高。mdn1-1突变体是单碱基突变突变体，具有明显的表型缺陷但是能够存活;mdn1-2突变体为T-DNA插入突变体，导致MDN1功能缺失，纯合致死。斑点印记杂交实验表明，AtMDN1定位于细胞核，在mdn1-1突变体中，部分AtMDN1出现在细胞质中。观察核糖体大亚基融合蛋白(RPL16D-GFP)和小亚基融合蛋白(RPS13A-GFP)的荧光分布，发现在mdn1-1突变体中pre-60S的核输出异常。检测rRNA前体(pre-rRNA)的积累，发现35S、27SB和20Spre-rRNA在mdn1-1突变体中的积累量增加，表明pre-rRNA主要的加工途径可能被改变。蛋白互作验证表明，AtMDN1与拟南芥中的另外两个酵母RBFs同源蛋白(PESCADILLO2/PES2和NOCHELESS/NLE)相互作用。mdn1-1突变体对放线菌酮(蛋白翻译抑制剂)处理敏感，表明mdn1-1突变体的翻译效率下降。上所述结果表明，拟南芥MDN1参与60S核糖体的合成。
2.核糖体合成与生长素构成反馈调节环调控植物生长发育。核糖体合成缺陷突变体通常表现出生长素缺陷相关表型，但是目前尚不清楚核糖体合成缺陷与生长素之间的联系。使用生长素响应DR5:GUS和DR5rev:GFP报告株系进行观察，发现mdn1-1突变体子叶、主根和叶片边缘的生长素响应和响应分布异常。使用流式细胞仪对主根进行检测，发现处于G0/G1期的根细胞数量在mdn1-1突变体中显著增加。在mdn1-1突变体中，生长素合成基因(YUC3、YUC5、YUC7、YUC8、YUC9和TAA1)的表达量下降，生长素极性运输载体AUX1和PIN1的蛋白积累量下降，PIN3和PIN7的基因表达量下降，而PIN2的蛋白积累量增加。转录组分析结果表明，mdn1-1突变体主根中生长素合成、信号转导和生长素响应相关基因的表达量下降。在mdn1-1突变体中，根生长调控因子PLT1和PLT2的基因表达量下降，SCR和SHR的蛋白积累量增加。生长素能激活MDN1的表达，酵母单杂交实验显示ARFs可能直接与MDN1启动子结合。在mdn1-1突变体中，MDN1的表达量下降。上述结果表明，核糖体合成与生长素可以形成反馈调节环调控植物的生长发育。
3.AtMDN1调控胚胎发育。mdn1-1突变体果荚变短，成熟种子数量减少且存在败育的种子，表明AtMDN1突变导致胚胎发育异常，但是目前尚不清楚其具体机理。mdn1-2突变体纯合植株致死，在mdn1-2/+杂合突变体的果荚中发现停止发育的胚珠，其胚胎发育停滞在早期球形胚时期，进一步表明AtMDN1可能参与拟南芥早期胚胎发育的调控。观察mdn1-1突变体胚胎发育的过程，发现mdn1-1突变体胚胎发育迟缓，而且在球形胚时期存在4种形态异常的胚胎。AtPES2和AtNLE分别在核仁和核质中与AtMDN1相互作用。拟南芥pes2-1和nle-1突变体分别为AtPES2和AtNLE的T-DNA插入突变体，导致AtPES2和AtNLE功能缺失，纯合植株致死。在杂合突变体pes2-1/+和nle-1/+的果荚中也存在败育的种子，其胚胎同样在早期球形胚时期发育停滞。上述结果表明，AtPES2和AtNLE与AtMDN1类似，也可能在拟南芥早期胚胎发育中发挥重要的作用。球形胚时期胚胎发育异常可能与该时期胚胎的发育需要大量的核糖体来满足快速的细胞分裂对蛋白质的需求有关。利用生长素响应DR5rev:GFP报告株系，发现球形胚时期的生长素稳态和生长素响应在mdn1-1突变体中受到明显影响，表明AtMDN1可能在维持球形胚时期生长素的稳态和生长素响应方面也发挥重要作用。
4.AtMDN1调控拟南芥开花。RP和RBFs突变通常会导致植物生长迟缓和开花延迟，但是目前尚不清楚核糖体突变如何调控开花时间提前。本研究发现，mdn1-1突变体在长日照(LD)和短日照(SD)条件下开花时间提前。转录组分析结果表明，自主途径相关基因和ABI5的基因表达量上调以及FLC的表达量下调可能在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1flk和mdn1-1fve-4双突变体能够抑制mdn1-1突变体的早花表型，表明FLC表达量下降在mdn1-1提前开花中发挥重要的作用。mdn1-1flk和mdn1-1fve-4双突变体能够显著恢复flk和fve-4突变体的晚花表明，表明MDN1突变同时产生了FLC-independent的调控变化。mdn1-1flc-3双突变体开花时间晚于flc-3和mdn1-1突变体，表明FLC在mdn1-1的花期调控中发挥重要的作用，FLC突变后，其它信号途径可能不足以调控mdn1-1的早花表型。mdn1-1abi5双突变体开花时间晚于野生型和mdn1-1，表明ABI5在MDN1突变导致的核糖体合成缺陷对植物花期的调控中发挥重要的作用。mdn1-1clf-28开花时间早于mdn1-1而晚于clf-28，可能与mdn1-1中FT的表达量下降有关，在mdn1-1中提高FT的表达量能进一步促进其开花时间。mdn1-1co和mdn1-1ft-10双突变体抑制mdn1-1突变体的早花表型，表明光周期途径影响mdn1-1的开花时间。
5.RPL16D平衡植物的生长和抗病性。拟南芥过表达RPL16D(L16D-OEs)导致植物在营养生长后期(21DAG开始)叶片卷曲、叶柄变短。莲座叶的转录组和蛋白质组分析结果表明，调控植物生长相关蛋白(如固醇和BR合成、细胞壁合成蛋白)的积累量在L16D-OEs中显著下降;同时，抗病相关基因的表达量和蛋白的积累量显著上调，暗示L16D-OEs的抗病性提高。假单胞杆菌(Pst DC3000)的侵染实验表明L16D-OEs的抗病性显著提高。上述结果显示，过表达RPL16D会减缓植物的生长，同时赋予植物更强的抗病性，表明RPL16D可能在平衡植物生长和植物抗病方面发挥重要作用。因此，通过转基因的方法适量提高RPL16D的蛋白剂量，可能在作物的遗传改良中具有很好的应用前景。
6.创新与应用——创建简单高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系。LEAFYCOTYLEDON2(LEC2)在整个胚胎发育阶段发挥维持细胞胚性特性的作用。我们前期的研究表明，在烟草(N.tabacum)中，通过DEX诱导AtLEC2-GR向细胞核的转运，可以在幼苗茎尖产生胚性愈伤，但是胚性愈伤的芽再生效率较低。细胞分裂素可以诱导芽的再生，因此本研究探究在AtLEC2-GR烟草中过表达拟南芥细胞分裂素合成酶(Isopentenyl Transferase，IPT)基因(AtIPT3、AtIPT7和AtIPT9)对芽再生效率的影响。AtIPT7-OEAtLEC2-GR和AtIPT9-OEAtLEC2-GR幼苗在DEX诱导下可以在茎尖产生胚性愈伤，而且在不含激素的培养基中，芽再生效率分别比AtLEC2-GR提高2倍和3.5倍。本研究利用GR-DEX诱导表达系统，构建了一个高效的胚性愈伤诱导和芽再生体系，该体系可以不依赖外源激素，在含有DEX的培养基中诱导胚性愈伤的产生，在不含有DEX的培养基中显著提高胚性愈伤的芽再生数量。