目的食管癌是世界上最常见的10种恶性肿瘤之一,每年新增患者超过30万人,已经成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一,严重危害人类健康。我国是世界上食管癌发病率最高的地区,2008年死于食管癌的人数约为21.1万,超过全世界食管癌死亡病例数的一半以上,其中87.0%的病理类型为鳞状细胞癌。研究表明食管癌的病变过程非单个分子事件,而是一个多步骤、多阶段、长时间、多基因参与的复杂性生物学过程,大多经过上皮增生、上皮内瘤变到浸润癌的过程,涉及多方面因素,如癌基因和抑癌基因的改变、细胞信号转导通路异常、细胞增殖调控紊乱等；同时,有证据显示环境暴露、肿瘤发生部位、肿瘤大小、肿瘤浸润程度、淋巴结转移等因素与其发生、发展具有一定的内在联系,而且对于食管癌的早期诊断、判断预后、治疗及预防等方面都有重要的意义,将会为食管癌的诊断与治疗提供科学的理论基础与新的途径。然而,食管癌具有高侵袭性和高度转移倾向的生物学特点,总体治疗效果欠佳,远期生存一直未能有显著提高,术后复发和转移是治疗失败的主要原因。如何控制肿瘤复发和转移成为治疗食管癌的关键,研究其复发和转移机制,寻找治疗食管癌的新方法、新靶点成为众多医学工作者关注的焦点。本课题研究发现临床手术标本中趋化因子受体CXCR4的表达与食管鳞癌的淋巴结转移和TNM分期相关,提示CXCR4的高表达与食管鳞癌的恶性程度、侵袭转移、预后相关。拟在此基础上应用体外培养肿瘤细胞模型EC9706细胞株,通过侵袭转移实验、粘附实验,进一步深入研究趋化因子受体CXCR4在食管鳞癌浸润转移中的作用,同时通过RT-PCR和westernblotting检测癌细胞EGFR mRNA及蛋白水平表达情况,深入研究其侵袭和转移机制,为探讨CXCR4成为食管癌的新方法、新靶点提供理论依据。方法1.采用免疫组化的方法检测2011-07-01日～2012-12-31日期间,174例食管鳞状细胞癌及50例癌旁正常组织中趋化因子受体CXCR4的表达情况,同时纪录患者的性别、年龄、肿瘤发生不同部位、肿瘤大小长度、吸烟嗜好、饮酒嗜好、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、TNM分期等临床病理因素并采用秩相关分析患者CXCR4水平与其相关性,采用χ2检验分析各组免疫组化阳性表达率差异。2.取对数生长期的食管鳞癌EC9706细胞,常规胰酶消化后,将细胞浓度调整为1×106个/mL,接种于培养板中,培养12h后,分别添加趋化因子CXCL12,使其终浓度为10μg/mL、5μg/mL,另设空白培养基作阴性对照,每组设3个复孔,作用24h后,吸去培养液,收集细胞,通过侵袭转移实验、粘附实验分别检测食管鳞癌EC9706细胞株细胞侵袭、移动、粘附能力。3.取对数生长期的食管鳞癌EC9706细胞,胰酶消化后,将细胞浓度调整为1×106个/mL,接种于培养板中,培养12h后,分别添加趋化因子CXCL12,使其终浓度为10μg/mL、5μg/mL,另设空白培养基作阴性对照,每组设三个复孔,作用24h后,吸去培养液,收集细胞,通过RT-PCR和westemblotting检测细胞EGFR mRNA及蛋白水平表达情况。结果1.免疫组化染色结果显示174例食管鳞状细胞癌患者病理标本着不同程度棕黄色或棕褐色,Ⅰ期标本着淡棕黄色,Ⅱ、Ⅲ期着棕黄色,而Ⅳ期着棕褐色。阴性对照组无着色,正常对照组无着色或少数着淡棕黄色,CXCR4在174例食管鳞状细胞癌及50例癌旁正常组织中的阳性表达率分别为67.8%(118/174)、32.5%(16/50)；CXCR4在食管鳞癌组织中有较高的表达,在癌旁正常组织表达较低,二者差异有统计学意义,(χ2=10.16,P<0.01)。CXCR4在食管鳞状细胞癌组织中的表达与临床病理特征的关系：经Spearman相关分析,CXCR4的表达与淋巴结转移、TNM分期成正相关(r>0,P<0.05),食管鳞癌有淋巴结转移、TNM分期越晚,CXCR4的表达水平就越高。CXCR4的表达与患者的性别、年龄、肿瘤发生不同部位、肿瘤大小、饮酒嗜好、肿瘤浸润程度等其他因素无关。提示CXCR4的表达与食管鳞癌的恶性程度、侵袭和转移相关。2.细胞粘附试验结果显示,细胞经不同处理,与ECM的粘附能力不同。添加空白培养基、趋化因子CXCL125μg/mL及10μg/mL粘附细胞的平均光密度值分别为0.12±0.021、0.25±0.011和0.38±0.006,癌细胞与ECM的粘附能力有显著性差异,其中添加趋化因子CXCL1210μg/mL表现出更强的与ECM的粘附能力,空白培养基最弱,三者之间差异显著(两两比较,P<0.01)。试验结果表明癌细胞与ECM的粘附能力与趋化因子CXCL12密切相关,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,能力越强。添加空白培养基、趋化因子CXCL125μg/mL及10μg/mL,癌细胞穿过人工基底膜的细胞数分别为5.3±1.8,18.9±2.1和41.2±4.6,其中添加趋化因子CXCL1210μg/mL表现出更强的侵袭、迁移能力,空白培养基最弱,三者之间差异显著(两两比较,P<0.01)。这一结果同细胞粘附实验结果一致,充分证明添加不同浓度趋化因子CXCL12与细胞的侵袭、迁移能力密切相关,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,癌细胞侵袭、迁移能力越强。添加趋化因子不同浓度CXCL12,食管鳞癌EC9706细胞株细胞侵袭、移动、粘附能力均较空白对照组高,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,能力越强,差异有显著性(两两比较,P<0.01)。添加不同浓度趋化因子CXCL12癌细胞跟ECM的粘附能力、侵袭转移密切相关,而CXCL12作用于CXCR4,使CXCR4表达上调,诱导肿瘤细胞生长和转移,而表达CXCR4的肿瘤细胞可以通过CXCL12/CXCR4介导的途径发生浸润、转移。进而引起肿瘤侵袭、转移。试验结果表明CXCR4的高表达与肿瘤侵袭、转移相关。3.经不同处理,癌细胞EGFR基因mRNA表达水平显著不同,经内参P-actin标准化后,添加空白培养基、趋化因子CXCL125μg/mL及10μg/mL与其比值分别为0.103±0.044、0.851±0.167、1.114±0.732,其中添加趋化因子CXCL1210μg/mL表现出更强的mRNA表达,空白培养基最弱,三者之间差异显著(两两比较,P<0.01)。试验结果表明癌细胞EGFR基因mRNA表达水平与趋化因子CXCL12密切相关,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,表达越强。经不同处理,癌细胞EGFR蛋白表达水平显著不同,经内参β-actin标准化后,添加空白培养基、趋化因子CXCL125μg/mL及10μg/mL与其比值分别为0.065±0.033、0.443±0.101、0.907±0.226,其中添加趋化因子CXCL1210μg/mL表现出更强的蛋白表达,空白培养基最弱,三者之间差异显著(两两比较,P<0.01)。试验结果表明癌细胞EGFR蛋白表达水平与趋化因子CXCL12密切相关,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,表达越强。RT-PCR和Western blotting检测结果显示,添加不同浓度趋化因子CXCL12,EC9706细胞株细胞EGFR mRNA及蛋白水平表达均较对照组表达高,并且存在剂量依存关系,CXCL12浓度越大,表达越高,差异有显著性(两两比较,P<0.01)。而CXCL12作用于CXCR4,使CXCR4表达上调,进而使EGFR mRNA及蛋白表达水平升高,导致细胞内酪氨酸蛋白激酶活化,促进二聚体的磷酸化,进而使位于羧基末端位点上的酪氨酸残基发生磷酸化,激活一系列信号传导通路,使细胞出现异常增殖和凋亡障碍,而促进肿瘤的形成、进展。结论1.CXCR4在食管鳞癌组织中高表达,且与淋巴结转移和TNM分期具有正相关性。CXCR4对食管鳞癌的发生、发展、转移起促进作用,对于食管鳞癌的早期诊断、预后判断、治疗选择具有重要的意义。2. CXCR4的高表达与肿瘤侵袭、转移相关,并且存在剂量依存关系,CXCR4表达水平越高,肿瘤侵袭、转移能力越强。3. CXCR4有可能通过调控EGFR基因和蛋白的表达参与食管鳞癌的浸润转移,是其参与食管鳞癌浸润转移的可能机制之一。