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研究目的:慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是一种骨髓多能造血干细胞恶性增殖性疾病,在我国的发病率约为1/10万,占成年人白血病发病率的20%左右,是常见的白血病类型。从中医药学角度分析该病属于“血证”“积聚”“虚劳”等范畴,其病因多虚实夹杂,实邪多为瘀毒湿热,虚邪多为正气不足。临床上也多以清热化瘀解毒,补益正气为治疗大法。但是中医药在CML中发挥优势治疗作用的机制机理尚未得到具体阐述。随着分子生物学对该病研究的深入,许多学者认为BCR-ABL基因的形成是导致CML发生发展和耐药的关键因素之一,因此BCR-ABL融合蛋白是治疗慢性粒细胞白血病的潜在主要靶点。那么,实现中医药与分子生物学在CML临床治疗上的有效结合,阐明其抗CML的作用机制是本研究的目的之一。已有相关研究表明,BCR-ABL蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)降解,因此通过UPP对BCR-ABL蛋白水平进行调控对CML的治疗具有非常重要的科学指导意义。泛素蛋白酶体途径由几个关键的酶所介导,包括泛素激活酶(Ubiquitin-Activating Enzymes,Els),泛素结合酶(Ubiquitin-Conjugating Enzymes,E2s),泛素连接酶(Ubiquitin Ligases,E3s)和去泛素化酶(Deubiquitinases,DUBs)。在El,E2和E3的共同作用下,细胞中靶蛋白可以发生泛素化修饰和降解,而去泛素化酶则可以使泛素化的蛋白发生去泛素化作用,从而使靶蛋白免于被降解。因此,本研究的目的在于:(1)发现BCR-ABL泛素化修饰的去泛素化酶;(2)阐明该去泛素化酶的作用机制和对CML的影响;(3)筛选出能够通过参与上述机制发挥抗慢性粒细胞白血病作用的具有生物安全性的中药成分,从而为中医药在CML的靶向治疗方面提供科学参考依据。研究方法:1、收集白血病细胞株,用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测BCR-ABL蛋白的表达情况,并用蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米(Bortezomib,BZ)处理慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01后用WB探究蛋白酶体抑制剂对BCR-ABL蛋白水平的影响。2、在HEK293T细胞中共转染BCR-ABL质粒与DUBs质粒,采用WB检测BCR-ABL的蛋白表达水平,筛选出可上调BCR-ABL蛋白水平的DUB相关蛋白USP7。3、细胞在放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理后用WB分析USP7对BCR-ABL蛋白稳定性和半衰期的影响。4、利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)技术分析 USP7 和 BCR-ABL的相互作用关系。5、利用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)技术和WB方法检测USP7对BCR-ABL蛋白泛素化水平的影响。6、使用USP7的小分子抑制剂P5091抑制USP7的功能后,通过WB、IP方法检测BCR-ABL蛋白水平及泛素化的水平的变化。7、制备USP7的慢病毒并侵染慢性粒细胞白血病细胞,探究过表达USP7对内源性BCR-ABL蛋白表达以及对慢性粒细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响和RT-PCR检测BCR-ABL的mRNA水平的变化。8、用siRNA处理细胞,探究敲低USP7对内源性BCR-ABL蛋白表达以及对慢性粒细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响和RT-PCR检测BCR-ABL的mRNA水平的变化。9、筛选出能够抑制BCR-ABL蛋白水平的天然小分子化合物青蒿琥酯(Artesunate,ART),并探究其在慢性粒细胞白血病中的作用机制。10、流式细胞技术检测ART对慢性粒细胞白血病细胞凋亡的影响,并通过WB检测ART与第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib,IM)联合使用后BCR-ABL蛋白水平的变化。研究结果:1、收集白血病细胞株,并进行表达谱实验,WB结果显示BCR-ABL在慢性粒细胞白血病细胞系(K562和MEG01)表达;在K562和MEG01细胞中加入蛋白酶体抑制剂(MG132和BZ)和溶酶体抑制剂(CHQ)处理12 hrs后,发现加入MG132和BZ后,BCR-ABL表达水平明显上升,而CHQ组没有变化,提示BCR-ABL可以通过蛋白酶体途径降解。2、将BCR-ABL质粒与不同的DUB质粒共转染染到HEK293T细胞中,36 hrs后,收集细胞,提取蛋白,用WB分析共转染后BCR-ABL的蛋白水平,发现USP7能明显上调BCR-ABL的蛋白表达水平,并且这种上调作用呈现出对USP7的时间和浓度梯度依赖性。3、采用慢病毒侵染慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞36 hrs后,通过在同一时间加入能够抑制蛋白质合成的CHX,在不同的时间点(0、4、8、12和24hrs)收集细胞,提取蛋白,用WB的技术和方法,实验结果显示USP7显著延长了 BCR-ABL蛋白的半衰期。4、将BCR-ABL质粒和Flag-USP7质粒共转染染到HEK293T细胞中,共转染36 hrs,以及通过直接收集慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01,利用Co-IP技术和方法处理收集的细胞,实验结果显示USP7与BCR-ABL存在相互作用的关系。5、将BCR-ABL质粒、HA-Ub质粒和Flag-USP7质粒共转染染到HEK293T细胞中,共转染36 hrs后,通过IP和WB的技术和方法,实验结果显示USP7能够降低BCR-ABL的泛素化水平,并呈时间和浓度梯度性稳定BCR-ABL蛋白水平。6、在慢性粒细胞白血病细胞株K562中,用小分子抑制剂P5091处理12hrs后,收集细胞,提取蛋白,通过IP和WB的技术和方法,实验结果显示当P5091抑制USP7的功能后,BCR-ABL的泛素化水平得到明显稳定。7、用慢病毒侵染慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01细胞36 hrs后,用WB和MTT的技术和方法,实验结果显示过表达USP7能够显著稳定内源性BCR-ABL蛋白水平,促进CML细胞增殖,RT-PCR结果显示对其mRNA水平几乎没有影响。8、在慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01中,用siRNA处理细胞,敲低USP7的表达后,WB和MTT结果显示USP7降低内源性BCR-ABL的蛋白稳定性,同时抑制CML细胞增殖,RT-PCR结果显示对其mRNA水平几乎无影响。9、用天然小分子化合物青蒿琥酯(Artesunate,ART)处理慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01细胞24 hrs后,通过WB和流式细胞技术(Flowcytometry,FCM)发现ART能够并呈浓度梯度依赖性降低BCR-ABL的蛋白稳定性并诱导CML细胞发生凋亡。10、在慢性粒细胞白血病细胞株K562和MEG01中,用青蒿琥酯处理24 hrs后,收集细胞,提取蛋白,通过Co-IP和WB的技术和方法,实验结果显示ART能够抑制USP7与BCR-ABL之间的相互作用,同时青蒿琥酯与伊马替尼(Imatinib,IM)联合使用后能够显著降低BCR-ABL蛋白稳定性。结论:本研究利用WB、Co-IP、IP、MTT以及FCM等实验技术和方法证明了 USP7与BCR-ABL的相互作用关系,以及确定了 USP7是BCR-ABL蛋白的去泛素化酶。进一步的研究发现USP7能够稳定BCR-ABL的蛋白水平,通过介导BCR-ABL的去泛素化进而抑制BCR-ABL的泛素化降解。天然小分子化合物青蒿琥酯能够降低BCR-ABL的蛋白稳定性,诱导CML细胞发生凋亡,抑制USP7与BCR-ABL之间的相互作用,并且能够与伊马替尼联合使用产生明显的抗CML协同效应。