研究背景和目的众所周知,肥胖可以通过诱发胰岛素抵抗、高血糖、高血压、高血脂等一系列代谢综合征,导致Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等心血管疾病甚至癌症,威胁人类的健康。当体内能量的摄入大于消耗时,过多的能量以脂肪形式储存。脂肪组织可以分为白色脂肪和棕色脂肪,其中白色脂肪储存能量,缓解机械损伤。棕色脂肪产热消耗能量,调节体温。寒冷或者高脂饮食的条件通过激活下丘脑的交感神经系统释放去甲肾上腺素。去甲肾上腺素可作用于棕色脂肪的肾上腺素能受体,激活cAMP-PKA-CREB级联反应,增强线粒体内膜解偶联蛋白1(uncoupling protein-1,UCP-1)介导的非耦联呼吸过程,使能量以热量的形式散发,减轻体重。此外,肌肉组织亦受到下丘脑-交感神经系统的调控,介导代谢适应并参与机体的能量代谢。亚精胺是多胺的一种,广泛存在于所有生物体中。研究表明,口服或肠道微生物群合成的外源性多胺能够促进小鼠长寿。在动物模型中,亚精胺补充剂具有心脏保护的作用。此外,在高脂饮食小鼠模型中,腹腔注射亚精胺通过诱导白色脂肪组织自噬,减轻小鼠的体重和肝脂肪变性,有效改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。然而,探究口服亚精胺对饮食诱导肥胖及代谢紊乱的影响少有涉及,口服亚精胺对其他代谢组织的影响及机制也并不完全清楚。本研究利用口服亚精胺对饮食诱导肥胖小鼠进行干预,证实了口服亚精胺可以减缓高脂饮食小鼠的肥胖进展,并抑制脂肪组织炎症和代谢紊乱。口服亚精胺可以促进下丘脑中酪氨酸羟化酶的表达,诱导棕色脂肪活化和增强肌肉的代谢适应,从而为饮食诱导肥胖的干预治疗提供了新的思路和方向。方法一、小鼠肥胖模型的建立及口服亚精胺的干预治疗C57BL/6雄性小鼠在8周龄时给予60%高脂饲料喂养28-32周,以建立饮食诱导肥胖模型,对照组小鼠采用常规饲料喂养。在高脂饮食喂养12-16周后进行口服亚精胺干预治疗。二、口服亚精胺对高脂饮食小鼠肥胖的影响在高脂饮食喂养过程中,每周对实验组和对照组小鼠进行称重。干预治疗结束后,称量各组小鼠体重,观察口服亚精胺干预对体重的影响。麻醉处死小鼠,取附睾及皮下处白色脂肪组织,进行称重,计算各部分脂肪组织重量占体重的百分比,进行统计分析。三、口服亚精胺对高脂饮食小鼠代谢参数的影响分别对实验组和对照组小鼠进行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test,GTT)、胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)检测。GTT实验中,腹腔注射葡萄糖后,在不同时间点检测小鼠血糖水平并进行统计分析。ITT实验中,腹腔注射胰岛素后,于不同时间点检测小鼠血糖水平并进行统计分析。四、口服亚精胺对高脂饮食小鼠白色脂肪组织炎症的影响亚精胺干预治疗结束后,麻醉处死实验组和对照组小鼠,取小鼠附睾处及皮下白色脂肪组织,石蜡包埋切片。HE染色后镜下观察脂肪细胞大小,并统计分析。取小鼠附睾处白色脂肪组织进行F4/80的免疫组织化学染色,观察口服亚精胺后白色脂肪组织中巨噬细胞浸润程度的变化。五、口服亚精胺对高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性的影响口服亚精胺干预结束后,麻醉处死实验组和对照组小鼠,取小鼠的肝脏组织,观察称重,记录肝脏重量并计算肝脏重量占体重的百分比,统计分析。石蜡包埋肝脏组织,对切片进行HE染色,镜下观察肝脏细胞脂肪变情况。检测各组肝脏组织匀浆中的甘油三酯的含量。六、口服亚精胺对高脂饮食小鼠棕色脂肪组织活化的影响口服亚精胺干预结束后,麻醉处死实验组和对照组小鼠,取各组小鼠的棕色脂肪组织,石蜡切片HE染色后观察脂肪细胞大小。取小鼠棕色脂肪组织进行UCP-1的免疫组织化学染色,观察染色结果。用实时荧光定量PCR的方法检测棕色脂肪组织中Ucp-1、Pgc-1α、Pgc-1β、Cpt-1α、Cpt-1β、Cidea的mRNA 表达水平。用 Western-blot 的方法检测CREB、p-CREB(Ser133)、UCP-1和PGC-1α在蛋白水平的表达。七、口服亚精胺对高脂饮食小鼠肌肉组织代谢的影响口服亚精胺干预结束后,麻醉处死实验组和对照组小鼠,取各组小鼠的比目鱼肌组织。用实时荧光定量PCR的方法检测Ucp-1以及Glut-4在mRNA水平的表达。用Western-blot 的方法检测 CREB、p-CREB(Ser133)、PGC-lα、UCP-1 以及 AKT、p-AKT(Ser473)在蛋白水平的表达。八、口服亚精胺对高脂饮食小鼠下丘脑和棕色脂肪中酪氨酸羟化酶表达的影响。口服亚精胺干预结束后,将小鼠麻醉处死,取实验组和对照组小鼠的下丘脑和棕色脂肪组织,用实时荧光定量PCR的方法检测下丘脑和棕色脂肪组织中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因在mRNA水平的表达。用Western-blot的方法检测各组小鼠下丘脑和棕色脂肪组织中TH在蛋白水平的表达。九、亚精胺刺激对SH-SY5Y细胞中酪氨酸羟化酶表达和去甲肾上腺素产生的影响以亚精胺刺激SH-SY5Y细胞16小时,同时设置阴性对照组。用实时荧光定量PCR的方法检测SH-SY5Y细胞中TH和SIRT1(Sirtuin1)在mRNA水平上的表达。刺激细胞24小时用后,用Western-blot的方法检测CREB、p-CREB(Ser133)及TH在蛋白水平的表达;收集亚精胺刺激SH-SY5Y细胞以及阴性对照组细胞的上清,使用ELISA试剂盒检测上清中的去甲肾上腺素含量,并进行统计。十、亚精胺对HIB-1B棕色脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞的直接与间接作用以不同浓度的亚精胺直接刺激HIB-1B前体细胞、HIB-1B棕色脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞。用 Western-blot 的方法检测 CREB、p-CREB(Ser133)和UCP-1、PGC-1α在蛋白水平的表达。用亚精胺刺激SH-SY5Y细胞的上清刺激HIB-1B前体细胞、HIB-1B棕色脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞。用实时荧光定量PCR的方法检测细胞中UCp-1、Pgc-1α的mRNA表达水平。用 Western-blot 的方法检测细胞中 UCP-1、PGC-1α、CREB、p-CREB(Ser133)的蛋白表达水平。结果一、口服亚精胺改善小鼠饮食诱导肥胖将饮食诱导肥胖的小鼠分为亚精胺干预组(HFD+SPD)和普通饮水组(HFD),以常规饲料和普通饮水喂养的小鼠作为阴性对照组(ND)。在高脂饮食喂养过程中,每周对各组小鼠进行称重。结果表明,HFD组小鼠的体重较ND组明显增加,亚精胺干预后高脂饮食小鼠的体重较HFD组明显下降。二、口服亚精胺改善高脂饮食小鼠的代谢紊乱ITT结果显示,HFD+SPD组小鼠的胰岛素敏感性较HFD组有明显的改善,且在多个时间点上均有统计学差异。GTT结果显示,HFD+SPD组小鼠的对外源性葡萄糖的耐受能力较HFD组并无明显差异。三、口服亚精胺减轻高脂饮食小鼠白色脂肪组织的病理性扩张和炎症反应亚精胺干预结束后,对小鼠各部分脂肪组织称重并统计。结果表明,HFD组小鼠的白色脂肪组织重量较ND组明显增加。亚精胺干预后高脂饮食小鼠的白色脂肪组织重量较HFD组明显下降。将小鼠皮下和附睾处的白色脂肪组织进行石蜡包埋切片,HE染色后观察。可以看到与HFD组相比,HFD+SPD组小鼠皮下和附睾处的白色脂肪细胞肥大明显改善。对小鼠附睾处白色脂肪组织进行F4/80的免疫组织化学染色,显示口服亚精胺干预减轻了高脂饮食小鼠白色脂肪组织中巨噬细胞的浸润。四、口服亚精胺减轻高脂饮食小鼠肝脏的脂肪变性口服亚精胺干预结束后,取小鼠的肝脏进行称重并对结果进行统计分析。发现与HFD组相比,HFD+SPD组小鼠的肝脏重量明显减轻。从肝脏组织切片的HE染色观察结果可见,与HFD组相比HFD+SPD组小鼠的肝脏细胞脂肪变明显改善。试剂盒检测各组小鼠肝脏组织匀浆中甘油三酯的含量,发现HFD+SPD组小鼠肝脏组织中甘油三脂的含量较HFD组明显下降。五、口服亚精胺促进高脂饮食小鼠棕色脂肪组织的活化口服亚精胺干预结束后,取小鼠肩胛处棕色脂肪组织进行实时荧光定量PCR。结果显示HFD+SPD组小鼠棕色脂肪组织中Ucp-1、Pgc-1α、Pgc-1β、Cpt-1α、Cpt-1β和Cidea在mRNA水平上的表达与HFD组相比有不同程度的升高。Western-blot结果显示,与HFD组相比,HFD+SPD组小鼠棕色脂肪组织中CREB、p-CREB(Ser133)、UCP-1和PGC-1α在蛋白水平的表达明显增高。对各组小鼠的棕色脂肪组织石蜡切片进行HE染色和UCP-1的免疫组织化学染色,结果发现与HFD组相比HFD+SPD组小鼠的棕色脂肪细胞明显减小,UCP-1的表达更高。六、口服亚精胺改善高脂饮食小鼠肌肉的代谢适应口服亚精胺干预结束后,取实验组和对照组小鼠的比目鱼肌组织进行实时荧光定量PCR,发现与HFD组相比,HFD+SPD组小鼠比目鱼肌中的Ucp-1和Glut-4的表达有明显上升趋势。Western-blot结果显示,与HFD组相比HFD+SPD组小鼠肌肉组织的CREB、p-CREB(Ser133)、AKT、p-AKT(Ser473)以及 PGC-1α、UCP-1 在蛋白水平上的表达增加。七、口服亚精胺促进高脂饮食小鼠下丘脑中酪氨酸羟化酶表达口服亚精胺干预结束后,取小鼠下丘脑组织进行实时荧光定量PCR。结果显示相比于HFD组,HFD+SPD组的小鼠下丘脑中Th的表达明显增强。Western-blot显示相同结果。小鼠的棕色脂肪组织的荧光定量PCR和Western-blot的结果显示,HFD+SPD组与HFD组小鼠的棕色脂肪组织中TH的表达无统计学差异。八、亚精胺促进神经细胞中酪氨酸羟化酶的表达和去甲肾上腺素的产生与对照组相比,亚精胺刺激能够促进SH-SY5Y细胞中TH和SIRT1在mRNA水平上的表达。在蛋白水平上,亚精胺增强CREB、p-CREB(Ser133)和TH的表达。ELISA检测结果显示,亚精胺刺激组的细胞上清中有更高水平的去甲肾上腺素。九、亚精胺通过神经细胞作用于棕色脂肪细胞和骨骼肌细胞实验组用亚精胺刺激SH-SY5Y细胞,同时设置阴性对照组。收集实验组和对照组的细胞上清刺激HIB-1B前体细胞、诱导后的HIB-1B棕色脂肪细胞以及C2C12骨骼肌细胞。Western-blot检测结果可见,实验组细胞上清刺激HIB-1B前体细胞可增强UCP-1、PGC-1 α在蛋白水平上的表达;实验组细胞上清刺激HIB-1 B棕色脂肪细胞可增强p-CREB(Ser133)、UCP-1、PGC-1α在蛋白水平上的表达;实验组细胞上清刺激C2C12骨骼肌细胞可增强CREB、p-CREB(Ser133)、UCP-1、PGC-1α在蛋白水平上的表达。实时荧光定量PCR检测结果可见亚精胺刺激SH-SY5Y细胞所得上清能够增强C2C12骨骼肌细胞Ucp-1、Pgc-1α的表达。十、亚精胺直接作用于棕色脂肪细胞和骨骼肌细胞不同浓度的亚精胺直接刺激HIB-1B前体细胞、HIB-1B棕色脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,设置阴性对照组。Western-blot检测结果可见,亚精胺直接刺激HIB-1 B前体细胞可增强UCP-1、PGC-1α在蛋白水平上的表达;亚精胺直接刺激HIB-1B棕色脂肪细胞可增强p-CREB(Ser133)、UCP-1、PGC-1α在蛋白水平上的表达;亚精胺直接刺激C2C12骨骼肌细胞可增强CREB、p-CREB(Ser133)、UCP-1、PGC-1α在蛋白水平上的表达。结论一、口服亚精胺减轻高脂饮食小鼠的肥胖和代谢紊乱二、口服亚精胺活化高脂饮食小鼠的棕色脂肪组织三、口服亚精胺改善高脂饮食小鼠的肌肉代谢适应四、口服亚精胺通过促进高脂饮食小鼠下丘脑中酪氨酸羟化酶的表达,促进棕色脂肪细胞活化和骨骼肌细胞的代谢适应五、亚精胺亦可直接作用于棕色脂肪细胞和骨骼肌细胞改善其代谢功能