单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)是一类跨膜蛋白,它的主要功能是转运单羧酸类物质进出质膜。体内常见的单羧酸类物质包括：乳酸、丙酮酸和酮体等。这些物质不能够自由穿过细胞膜,必须依靠相应的蛋白质-单羧酸转运蛋白来进行转运。单羧酸转运蛋白是一个大家族,目前已经发现有14个亚型。但在人体内,只有MCT1, MCT2和MCT4三个亚型具有乳酸转运能力。乳酸是动物体内最重要的一种单羧酸,并且是糖酵解的终产物。在糖酵解过程中,葡萄糖被酶解为丙酮酸,它或者进入线粒体内,经过三羧酸循环被氧化,或者被乳酸脱氢酶转化为乳酸。当乳酸的产生量,超过了三羧酸循环所能代谢的量后,把细胞内的大量乳酸迅速转移到胞外,成了维持糖酵解高效进行的关键。这就需要单羧酸转运蛋白来发挥作用。非控制性增长是肿瘤的一个主要特征。快速的生长导致了对营养物质需求的增加。这些营养物质包括葡萄糖,氨基酸和脂肪等。快速生长的肿瘤细胞在胞浆内所含的线粒体数量较少,所以即使是在氧充足的情况下,也主要依靠葡萄糖酵解来产生ATP,这种现象被称为"Warburg Effect"。肿瘤细胞内糖酵解的增强,导致了胞浆内乳酸和丙酮酸的聚集。但乳酸和内酮酸在胞浆内需要保持一个稳定的水平,这同样需要肿瘤细胞膜上的单羧酸转运蛋白来发挥作用。在神经元中,线粒体的动能活性尤为重要,尤其在突触区域,对能量的需求非常高。据估计,大脑消耗了人体代谢总能量20%。线粒体功能和分布的障碍能够引起局部区域钙离子以及能量产生和消耗的不平衡,从而影响神经元功能,导致突触功能障碍。在一些神经元退行性变的疾病中,比如Parkinson’s (?)病和Alzheimer’s (?)病,已经发现了在一些特定神经元中线粒体动能活性的改变。线粒体严格依赖于核基因组的编码,然而它们自己也有基因组,参与了电子传递链(Electron transport chain, ETC)的组成。作者通过对CaMKIIa启动子的控制,得到了一种尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase, UNG)突变的转基因小鼠。这种mutUNG1小鼠具有线粒体DNA毒性、凋亡、神经退行性变和行为损伤的特征。这类似于神经退行性病变,如阿尔茨海默病的第一症状。所以mutUNG1-expressing小鼠模型可以进一步用于神经退行性变疾病的机制研究。本研究首先对常氧和循环低氧培养的乳腺癌T-47D和脑胶质细胞瘤T98G细胞膜表面三种不同单羧酸转运蛋白的表达,利用免疫颗粒金标记透射电镜技术,进行最化比较。汀次报道了在低氧环境中,不同单羧酸转运蛋白在肿瘤细胞膜表面的变化趋势,为进一步了解肿瘤细胞的代谢,尤其是乳酸代谢,提供了理论基础,也为在肿瘤治疗过程中,选择性抑制某种单羧酸转运蛋白,控制肿瘤细胞的增殖和生长,提供了新的途径。接下来,通过对线粒体DNA毒性转基因小鼠,(?)nutUNG1-expressing模型鼠,线粒体DNA毒性引起海马神经细胞损伤的分析,揭示了广泛存在的神经退行性变疾病,如Alzheimer’s (?)病的病理学特征。了解这些病理特征的细胞内机制,对于提出正确的治疗方法有重要意义,并且线粒体功能的缺失似乎在疾病的发展过程中起到了至关重要的作用。到目前为止,走向鼠为我们提供了很多用别的生物学系统所不能得到的答案,表明了具有完整线粒体,功能正常的线粒体对于神经系统功能的正常发挥,是不可或缺的。最后通过对线粒体DNA毒性小鼠海马和小脑代谢相关蛋白变化的检测,更加深入的了解了mutUNG1表达引起的线粒体功能障碍对突触信息传递功能、葡萄糖转运及乳酸能量代谢所造成的影响。更是首次详细描绘了MCT1和MCT2在小鼠海马CA1区stratum radiatum区域和小脑分子层和颗粒层的分布差异及表达量的不同。为进一步了解正常及病理状态下,大脑能量代谢,尤其是葡萄糖代谢和乳酸代谢的规律,提供了形态学的依据。第一部分：单羧酸转运蛋白在低氧培养脑和乳腺肿瘤细胞膜表面的密度变化目的：分析不同氧环境下人体乳腺癌和脑胶质细胞瘤细胞膜表面的单羧酸转运蛋白密度变化,为揭示其乳酸代谢特点提供理论依据。方法：1.人乳腺癌T-47D和脑胶质细胞瘤细胞T98G分别在4%循环低氧和20%常氧状态下培养。2.在培养过程中,检测培养液中pH、乳酸和葡萄糖浓度的变化。3.采用Western blotting方法检测所用5种一抗的特异性。4.采用后包埋免疫金颗粒标记透射电镜技术对肿瘤细胞膜表面不同MCTs进行标记。5.使用透射电镜对肿细胞膜表面区域观察拍照,通过Image J软件对电镜照片膜表面区域进行分析,得出不同氧环境对肿瘤细胞膜表面MCTs表达密度的影响。结果：1.肿瘤细胞在循环低氧环境下培养,其能量代谢方式和常氧状态下培养的肿瘤细胞之间发生了变化,表现为培养液中pH值,乳酸和葡萄糖的浓度变化趋势不同。2.实验所使用的三类MCT1, MCT2和MCT4,共5种单羧酸转运蛋白抗体经Western blotting检测,具有良好特异性。3.电镜图片统计结果显示,MCT1和MCT4在低氧培养的两种肿瘤细胞膜表面都表现出了表达上调。MCT2在低氧培养的乳腺癌T-47D细胞膜表面的密度增加了,而在同样是低氧环境下培养的胶质细胞瘤T98G细胞膜表面的密度却降低了。结论：1.循环低氧状态可以引起肿瘤细胞代谢模式的转变。2.不同单羧酸转运蛋白的协同作用,对肿瘤细胞适应不同氧环境发挥重要功能。也为阻断相应蛋白,抑制肿瘤细胞的生长和代谢,提供了新的思路。第二部分：线粒体DNA毒性对线粒体动能活性的影响目的：通过对线粒体DAN毒性模型鼠mutUNG1-expressing小鼠的研究,探究线粒体DNA毒性对线粒体动能活性的影响。方法：1.制作mutUNG1-expressing转基因小鼠。2.定最PCR检测小鼠海马线粒体总DNA拷贝数及线粒体DNA的表达量。3.激光共聚焦免疫荧光图像分析技术显示mutUNG 1-expressing小鼠海马内相关蛋白的改变。结果：1. mutUNG1-expressing小鼠海马内线粒体动能活性的缺失。2. mutUNG1-expressing小鼠中mtDNA数量和转录水平显著降低。3.线粒体DNA编码障碍影响了电子传递链的效能。4. mutUNG1的表达导致海马内星形胶质细胞的增生5.海马内的抗氧化防御系统在mutUNG1-expressing小鼠内受到影响。6.海马的氧化应激引起的DNA损伤和APE1的重新分布。结论：对mutUNG1-expressing模型鼠,线粒体DNA突变引起海马神经细胞损伤的分析,揭示了广泛存在的神经退行性变疾病,如Alzheimer’s病的病理学特征。了解这些病理特征的细胞内机制对于提出正确的治疗方法有重要意义,并且线粒体功能的缺失似乎在疾病的发展过程中起到了至关重要的作用。第三部分：线粒体DNA毒性小鼠脑内能量代谢相关蛋白的变化目的：通过对线粒体DNA毒性小鼠海马和小脑能量代谢相关蛋白分布和调整的形态学研究,了解神经退行性变疾病脑内能量代谢变化的规律。方法：1. mutUNG1-expressing转基因小鼠的制作。2.3只4月龄mutUNG1-expressing小鼠和3只同龄同基因型野生型小鼠被灌注取脑,并进行透射电镜的组织准备。3.超薄切片的制作及6种抗体(NR2A/B, GluRl, GluR2/3, GLUT1, MCT1,MCT2)免疫金颗粒的标记。4.电镜图片的拍摄及相关抗体在相应区域表达变化的分析。结果：1. NMDA受体(NR2A/B)标记的兴奋性突触,突触后膜的长度(PSD length)在mutUNG1-expressing小鼠海马stratum radiatum区域的长度缩短,但在Hilus区域却增长。2. mutUNG1的表达导致海马内AMPA受体的缺失和PSD长度的异常。3. mutUNG1的表达导致线粒体在海马颗粒细胞核周的聚集。4. GLUT1在海马和小脑微血管内皮细胞管腔面(luminal membrane)和基底面(abluminal membrane)上的密度,在线粒体DNA毒性小鼠和野生型小鼠之间没有显著性差别。5.MCT1在海马stratum radiatum区微血管内皮细胞管腔面和基底面上的表达高于在小脑内的表达,且mutUNG1-expressing小鼠MCT1在海马的表达较野生型小鼠下降。6.MCT2在海马和小脑颗粒层星形胶质细胞终足上的表达显著高于小脑分子层。但小脑分子层却出现了大量MCT2标记的神经突触。同样在mutUNG1-expressing小鼠海马内MCT2的表达出现了下调。结论：作者通过对线粒体DNA毒性小鼠海马和小脑代谢相关蛋白变化的检测,更加深入的了解了mutUNG1表达引起的线粒体功能障碍对突触信息传递功能、葡萄糖转运及乳酸能量代谢所造成的影响。更是首次详细描绘了MCT1和MCT2在小鼠海马CA1区stratum radiatum和小脑分子层和颗粒层的分布差异及表达量的不同。为进一步了解正常及病理状态下,大脑能量代谢,尤其是葡萄糖代谢和乳酸代谢的规律,提供了形态学的依据。