研究背景蛇毒是由多种毒素蛋白组成的混合物。自然界中,蛇和蛇的天敌对毒液的耐受性很强,原因在于这些生物体内存在天然的解毒蛋白。华游蛇是一种抗毒能力很强的蛇。我们课题组曾从华游蛇血清中分离到一种PLA2抑制剂（sa PLIγ）,具有良好的抗蛇毒活性。前期我们还发现华游蛇对毒液不敏感,注射相当于小鼠2倍LD50剂量的五步蛇毒、眼镜蛇毒或蝮蛇毒后中毒症状不明显。华游蛇对毒液的耐受机制亟待解析。本研究对新型抗蛇毒药物的开发有重要意义。本研究包括三部分,主要研究方法及结果如下:研究内容一:华游蛇抗毒素组分的亲和分离及活性检测目的:本研究通过五步蛇毒亲和层析柱分离华游蛇血清及肝脏中的抗毒蛋白和结合蛋白,鉴定其组分,检测其抗蛇毒PLA2酶活性、体内抗出血和抗肌肉损伤活性。通过反向亲和分离五步蛇毒确定这些组分结合的靶标蛋白。方法:（1）亲和柱构建:将五步蛇毒与NHS活化琼脂糖凝胶偶联后装柱,构建五步蛇毒亲和层析柱。（2）分离和鉴定:将新鲜的华游蛇血清、肝匀浆和小鼠血清（对照）上样至五步蛇毒亲和层析柱。用PBS缓冲液洗去未结合组分,用Gly-HCl（p H3.0）缓冲液洗脱与毒素结合的组分。通过SDS-PAGE及Shotgun LC-MS鉴定其组分,以无抗蛇毒能力的小鼠血清的鉴定结果作参照,分析华游蛇血清中的毒素互作的抗蛇毒蛋白。（3）活性分析:蛋黄平板法检测抗蛇毒蛋白对蛇毒PLA2的活性抑制能力。检测抗蛇毒蛋白体内抗出血和肌肉肿胀活性。（4）反向分离和鉴定:将前面分离的华游蛇血清蛋白偶联至NHS-琼脂糖凝胶,构建抗蛇毒蛋白亲和层析柱,反向分离五步蛇毒,按上述相同的方法冲洗柱子,分离抗蛇毒蛋白的毒素靶标,通过SDS-PAGE及Shotgun LC-MS鉴定其组分。结果:（1）经质谱鉴定,通过亲和柱分离的的华游蛇血清蛋白和肝匀浆蛋白高度重叠,有两大类:一类是毒素抑制剂,包括PLA2抑制剂家族（PLIα,PLIβ,PLIγ）、胎蛋白家族蛋白（AHSG,金属蛋白酶抑制剂）和小血清蛋白（SSP）。另一类是毒素结合蛋白包括丝α-抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin）、ATP合酶亚基β（ATP synthase beta）、血红蛋白α链（hemoglobin alpha chain）、热休克蛋白（heat shock protein）、葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein）、翻译起始因子（translation initiation factor）,载脂蛋白（apolipoprotein B-100）、微管蛋白（tubulin）等。部分结合蛋白在小鼠血清中也存在,如载脂蛋白,血红蛋白等。（2）蛇毒亲和柱分离的华游蛇血清或肝脏蛋白能够抑制蛇毒PLA2酶活性,抗皮下出血、缓解肌肉出血和肿胀的效果。（3）经鉴定反向亲和柱分离的蛇毒主要有5个毒素家族,分别为金属蛋白酶、PLA2、丝氨酸蛋白酶、CRISP和C型凝集素蛋白家族。表明华游蛇体内存在多种蛇毒蛋白的抑制剂。研究内容二:注毒后华游蛇肝脏抑制剂的表达变化目的:本研究旨在探索华游蛇对蛇毒的耐受极限,检测华游蛇肝脏抑制剂基因表达与注毒量的量效关系,并探究华游蛇肝匀浆蛋白的综合抗蛇毒能力。方法:（1）华游蛇的注毒挑战实验:华游蛇称重后分组,每组三只,分别注射五步蛇毒、眼镜蛇毒和蝮蛇毒,以注射同等体积生理盐水为对照。根据蛇毒对小鼠的LD50剂量和蛇体重进行换算,按照小鼠的12倍LD50剂量,按倍数递增注毒量。注毒后观察中毒反应,24 h后存活认为华游蛇能够耐受;若死亡,则蛇毒挑战中止,记录华游蛇对毒液的最高耐受剂量。（2）华游蛇肝脏内抑制剂的表达和血清指标:注射后24 h断头处死各组华游蛇,观察各华游蛇注射点出血和溃烂情况,收集血液和肝脏。检测各组华游蛇血清的乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）的水平,评价对华游蛇的脏器和肌肉损伤。提取蛇肝脏RNA,以28s作为内参基因,RT-q PCR检测PLIα、PLIβ、PLIγ、AHSG、SSP和Serpin A1的表达。分析华游蛇的注毒剂量与其抑制剂表达是否存在剂量-效应关系。（3）华游蛇肝匀浆的抗蛇毒能力检测:制备华游蛇肝匀浆液,离心取上清得肝匀浆蛋白（LH）,蛋黄平板法检测LH抗蛇毒PLA2活性。小鼠皮下注射法检测LH抗出血活性,软件分析出血斑大小和光密度值,评价抗出血毒的能力。蛇毒诱导肌肉损伤时将蛇毒或蛇毒与LH混合物注射小鼠腓肠肌,检测各小鼠血清AST、ALT、CK、LDH水平,对腓肠肌进行切片和HE染色,评估LH对肝脏和肌肉的保护。Western Blot检测腓肠肌中IL-6、I L-1β、TNFα和IL-10等炎症因子和凋亡相关蛋白（Cleaved caspase 3、BAX和BCL-2）的表达。小鼠腹腔注射蛇毒或LH与蛇毒混合物,检测小鼠血清AST、ALT、CK、LDH、UA、Urea和AMY水平,评价蛇毒对心脏、肝脏、肾脏和胰腺的损伤及LH的保护作用。测定肝脏抗氧化酶CAT、SOD、GR、GPx活力,心脏、肝脏和肾脏的MDA与FRAP的水平,评价LH对注毒后脏器氧化损伤的保护效果。结果:（1）华游蛇对五步蛇毒、蝮蛇和眼镜均具有强耐受性。其最大耐受量分别是:五步蛇毒450 mg/kg(相当于小鼠50倍LD50),蝮蛇毒80 mg/kg(相当于小鼠40倍LD50量),眼镜蛇毒21 mg/kg(约小鼠40倍LD50剂量)。（2）注毒后华游蛇肝脏抑制剂PLIα、PLIβ、PLIγ、AHSG、SSP和Serpin A1的表达升高,且与注毒剂量存在量效关系。三组注毒华游蛇血清中LDH、CK在注毒后升高。（3）华游蛇LH具有良好的抗蛇毒活性。LH显著抑制了五步蛇毒、蝮蛇毒和眼镜蛇毒PLA2活性。LH对三种蛇毒引起的出血也有显著减轻效果。小鼠肌肉注毒后血清的AST、ALT、CK、LDH、UA、Urea和AMY水平明显升高,腓肠肌组织出现坏死、红细胞渗漏和炎性细胞的浸润,细胞凋亡加重,促炎因子IL-6、I L-1β、TNFα的释放增加,而LH干预后上述指标显著下降。另外,LH抑制了中毒小鼠肝脏CAT、SOD、GR、GPx等活力,抑制了心脏、肝脏和肾脏的MDA水平的升高与FRAP的下降,各组脏器的氧化损伤减轻。研究内容三:华游蛇PLIα的基因克隆、诱导表达和活性研究目的:克隆华游蛇PLIα基因,构建原核表达体系,实现PLIα的可溶性表达,并检测PLIα的抗蛇毒能力,探讨其抗蛇毒的作用机制。方法:（1）在NCBI数据库中检索蛇类PLIα序列,结合前期华游蛇肝脏RNA-Seq测序的结果,针对保守的信号肽区段和C末端设计华游蛇PLIα引物,提取肝脏RNA,扩增PLIα基因,获得PLIα序列,测序获取序列信息。（2）按DNA重组的方法,将PLIα序列与p ET-28a均进行双酶切,连接得到重组p ET 28a-PLIα,p ET 28a-PLIα用酶切和测序法验证载体准确连接后,转化表达菌株BL21（DE3）,于21℃下低温下培养,0.4 mmol/L IPTG（或自诱导培养基）诱导表达。12 h后收集菌体,Western Blot检测PLIα的表达。超声破菌,离心收集上清,用Ni-NTA亲和层析柱分离PLIα蛋白。（3）华游蛇PLIα的抗蛇毒能力检测:按前文方法检测PLIα抗蛇毒PLA2酶活性、抗出血毒活性和抗肌肉损伤活性。与第二部分相同,检测PLIα对肌肉注毒小鼠血清AST、ALT、CK和LDH的影响,对肌肉组织病理损伤的保护作用。评价PLIα抗蛇毒导致的系统损伤活性,测定肝脏CAT、SOD、GR和GPx活力,心脏、肝脏和肾脏的MDA与FRAP的水平,评估各组脏器的氧化损伤程度。（4）对PLIα干预蛇毒诱导的肌肉损伤进行机制探索,检测氧化应激指标CAT、SOD、GPx、GR和MDA。WB检测氧化应激相关蛋白NRF2、HO-1;炎症指标IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2;细胞凋亡相关指标Cleaved caspase 3、BAX和BCL-2和相关通路蛋白IκB、p-IκB、P65、p-P65、ERK、p-ERK、p-AKT、AKT、ERK、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达。结果:（1）成功扩增出华游蛇PLIα的基因,大小为519 bp。序列比对结果显示,华游蛇PLIα与已知PLIα序列相似性为87.67%。成功表达了重组PLIα蛋白。（2）PLIα具有较好的抗PLA2活性及抗出血能力。PLIα减轻了五步蛇毒引起的肌肉损伤、细胞凋亡和氧化应激。（3）小鼠中毒后,炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）明显上调,凋亡（Cleaved caspase 3、BAX和BCL-2）,氧化应激（MDA、NRF-2和HO-1）加重。PLIα干预后,炎症、凋亡和氧化应激均有缓解。注毒小鼠腓肠肌p-IκB、p-P65、p-ERK、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表达明显升高,NF-κB/STAT3信号激活,而PLIα能干预NF-κB/STAT3信号的活化,减轻炎症反应。结论:（1）在华游蛇抗毒素组分中发现了包括PLIs、金属蛋白酶抑制剂、小血清蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂和毒素结合蛋白。（2）华游蛇对蛇毒具有超强的毒液耐受能力,与其肝脏内抑制剂的表达有关。且华游蛇肝脏匀浆有良好的抗蛇毒活性。（3）成功地克隆了华游蛇PLIα基因,PLIα显示出良好的抗蛇毒能力,且通过干预NF-κB信号通路和STAT3磷酸化,减轻蛇伤后的小鼠肌肉炎症反应。