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研究背景及目的:胰腺癌不断增长的发病率和居高不下的病死率使其成为公共卫生领域的重大挑战。胰腺癌发生发展的机制是当前的研究热点,这一领域的研究有助于寻找用于诊断的标志物和新的治疗靶点。FOXP1作为转录因子,可通过影响不同的下游分子的转录,在不同的肿瘤起促癌或抑癌作用。FOXP1还可在多种肿瘤和正常细胞中影响细胞增殖。此外,生物信息学预测显示FOXP1有数以千计的潜在靶基因,其中许多调控着细胞增殖与凋亡,并在肿瘤的发生发展起重要作用。虽然FOXP1在胰腺癌中的作用尚不明确,但是细胞的增殖与凋亡异常在胰腺癌发生发展中起关键作用。因此,我们推测,FOXP1可能通过影响细胞增殖相关生物学行为在胰腺癌的发生发展中起作用,但是它在胰腺癌中起抑癌作用还是促癌作用目前尚不清楚,在胰腺癌中它的下游效应分子也不清楚。转录因子IRF1在多种细胞中被证明是一个增殖抑制因子,同时,它在胰腺癌中是一个抑癌基因,其高表达与较好预后相关,但IRF1在胰腺癌中是否抑制细胞增殖尚不清楚,IRF1与FOXP1的关系也未见报道。本文研究了FOXP1在胰腺癌中表达及其与胰腺癌生物学行为的关系,并深入研究了机制,证明了FOXP1在胰腺癌中通过与IRF1启动子特定区域结合调控IRF1转录水平,进而影响细胞增殖相关生物学行为,FOXP1在胰腺癌中是一个抑癌基因。材料方法:（一）FOXP1在体内外与胰腺癌细胞增殖以及胰腺癌生长和预后的关系1.临床标本中分析FOXP1与胰腺癌大小和预后的关系:采用免疫组化染色检测了72对胰腺癌及其癌旁组织中FOXP1的表达,并分析二者之间的差异,及FOXP1表达与患者总生存期和肿瘤最大直径之间的关系。2.胰腺癌细胞系的选择:通过Western blotting检测人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE及4种常用人胰腺癌细胞系CFPAC1,SW1990,PANC1和CAPAN1中FOXP1的蛋白表达水平;通过CCLE数据库检索比较SW1990,PANC1细胞与所有其他胰腺癌细胞系的FOXP1 m RNA表达水平。3.FOXP1对胰腺癌细胞系增殖相关生物学行为影响的检测:采用FOXP1过表达质粒瞬时转染PANC1和SW1990细胞,通过CCK8观察细胞增殖,通过PI染色+流式细胞术检测细胞周期,PI/Annexin V双染+流式细胞术检测细胞凋亡。4.胰腺癌裸鼠模型构建及FOXP1对肿瘤生长和增殖凋亡的影响:通过pc DNA3.1（+）-FOXP1转染+G418筛选构建稳定表达FOXP1的PANC1细胞系,通过腋下皮下注射稳转细胞系构建裸鼠成瘤模型,通过游标卡尺测量和瘤体称重评估肿瘤生长,通过HE染色和FOXP1免疫组化鉴定模型,通过Ki67免疫组化和TUNEL染色评估细胞增殖和凋亡。（二）FOXP1通过IRF1影响胰腺癌细胞增殖相关生物学行为1.预测和筛选FOXP1可能的下游效应分子:使用TCGA数据库、GTRD和GSEA数据库预测得到FOXP1可能的下游效应分子,通过q PCR筛选得到候选下游效应分子IRF1,通过Western blotting检测FOXP1过表达对PANC1和SW1990细胞IRF1蛋白表达水平的影响,通过裸鼠皮下瘤免疫组化染色检测FOXP1过表达在体内对胰腺癌细胞IRF1蛋白表达水平的影响;2.FOXP1通过IRF1影响胰腺癌细胞增殖相关生物学行为:通过FOXP1过表达+IRF1敲减的rescue实验处理PANC1和SW1990细胞,通过CCK8观察细胞增殖,通过PI染色+流式细胞术检测细胞周期,PI/Annexin V双染+流式细胞术检测细胞凋亡。3.IRF1对胰腺癌细胞CDK2表达以及细胞增殖相关生物学行为的影响:采用IRF1过表达质粒瞬时转染处理PANC1和SW1990细胞,通过Western blotting检测CDK2表达,通过CCK8观察细胞增殖,通过PI染色+流式细胞术检测细胞周期,PI/Annexin V双染+流式细胞术检测细胞凋亡。通过裸鼠皮下瘤免疫组化染色检测比较FOXP1过表达组和对照组的CDK2蛋白表达水平。（三）FOXP1在IRF1启动子区域结合位点的确定通过JASPAR网站预测FOXP1在IRF1启动子区域的结合位点;通过Ch IP-PCR和Ch IP-q PCR确认FOXP1在IRF1启动子区域的结合位点;通过双萤光素酶报告基因实验检测野生型和结合位点突变型启动子应答于FOXP1并激活下游基因转录的能力。结果:（一）FOXP1在体内外与胰腺癌细胞增殖以及胰腺癌生长和预后的关系1.FOXP1表达与胰腺癌患者肿瘤大小以及总生存期的关系:72对胰腺癌及其癌旁组织免疫组化染色结果显示FOXP1在癌组织中的表达显著低于癌旁组织（P＜0.001）;根据FOXP1免疫组化染色评分的中位数值将72例癌组织分为FOXP1高表达组和低表达组,K-M检验显示FOXP1高表达组的OS显著优于低表达组（P＜0.001）;对72例癌组织的FOXP1表达水平和肿瘤大小进行了相关性分析,结果显示两者呈负相关（P＜0.0001）。根据以上结果,我们推测,在胰腺癌中FOXP1可能是一个抑癌基因。2.胰腺癌细胞系的选择:Western blotting检测人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE和4种常用人胰腺癌细胞系CFPAC1,SW1990,PANC1以及CAPAN1中FOXP1的蛋白表达水平,结果显示,所有细胞系的FOXP1蛋白表达水平均存在统计学差异（P＜0.01）,各细胞系两两比较则显示,FOXP1在SW1990和PANC1细胞中的表达水平均显著低于其他胰腺癌细系和HPDE细胞（P＜0.01）。CCLE数据库数据也显示,在所有胰腺癌细胞系中,SW1990和PANC1细胞的FOXP1表达处于较低水平,我们决定选择这两个细胞系进行后续实验。3.FOXP1影响了胰腺癌细胞系的增殖相关生物学行为:采用FOXP1过表达质粒瞬时转染PANC1和SW1990细胞,Western blotting验证了FOXP1过表达的效果（P＜0.01）,FOXP1过表达显著抑制细胞增殖（P＜0.01）,导致细胞周期G1期阻滞（P＜0.01）,并显著促进细胞凋亡（P＜0.01）。4.FOXP1在裸鼠模型中影响了胰腺癌生长等生物学行为:胰腺癌裸鼠模型构建及FOXP1对肿瘤生成和增殖凋亡的影响:oe FOXP1/Vector-PANC1细胞皮下接种裸鼠后成功成瘤,HE染色表明动物模型构建成功;oe FOXP1-PANC1细胞接种裸鼠的肿瘤体积和重量显著低于Vector-PANC1细胞接种裸鼠（P＜0.01）,免疫组化显示FOXP1在oe FOXP1-PANC1细胞接种的肿瘤内表达显著高于Vector-PANC1细胞接种的肿瘤（P＜0.01）,细胞增殖的标志物Ki67免疫组化显示oe FOXP1-PANC1细胞接种组肿瘤内增殖细胞百分比显著低于Vector-PANC1细胞接种组肿瘤（P＜0.01）;TUNEL染色表明oe FOXP1-PANC1细胞接种的肿瘤内细胞凋亡显著高于Vector-PANC1细胞接种的肿瘤（P＜0.01）。以上结果表明FOXP1可抑制胰腺癌的生长和细胞增殖,并促进细胞凋亡。（二）FOXP1通过调控IRF1表达进而影响胰腺癌细胞增殖相关生物学行为1.预测和筛选FOXP1可能的下游效应分子:使用TCGA数据库、GTRD和GSEA数据库预测得到FOXP1可能的下游效应分子IRF1和CDKN1A,FOXP1过表达显著促进了PANC1和SW1990细胞IRF1 m RNA的表达（P＜0.01）,但对CDKN1A m RNA的表达水平无显著影响（p＞0.05）;FOXP1过表达显著促进PANC1和SW1990细胞IRF1蛋白表达（P＜0.01）,裸鼠皮下瘤免疫组化染表明FOXP1过表达在体内显著促进了胰腺癌细胞IRF1蛋白表达（P＜0.01）。以上结果表明IRF1可能是FOXP1下游效应分子。2.FOXP1通过IRF1影响胰腺癌细胞增殖相关生物学行为:（1）通过FOXP1过表达+IRF1敲减的rescue实验处理PANC1和SW1990细胞,q PCR和Western blotting检测表明:在PANC1和SW1990两个细胞中,FOXP1过表达显著促进了IRF1蛋白和m RNA表达（si NC+oe FOXP1 vs.si NC+Vector,P＜0.01）;而IRF1敲减则显著逆转了FOXP1过表达引起的IRF1蛋白和m RNA表达水平上升（si IRF1+oe FOXP1 vs.si NC+oe FOXP1,P＜0.01）;提示我们的rescue实验模型构建是成功的。（2）进一步研究FOXP1对IRF1的调控对胰腺癌生物学行为的影响,结果表明在PANC1和SW1990两个细胞中,FOXP1过表达显著抑制细胞增殖（si NC+oe FOXP1 vs.si NC+Vector,P＜0.01）、引起细胞周期G1期阻滞（si NC+oe FOXP1 vs.si NC+Vector,P＜0.01）并促进细胞凋亡（si NC+oe FOXP1 vs.si NC+Vector,P＜0.01）;IRF1敲减则显著逆转了FOXP1过表达引起的细胞增殖抑制（si IRF1+oe FOXP1 vs.si NC+oe FOXP1,P＜0.01）、细胞周期G1期阻滞（si IRF1+oe FOXP1 vs.si NC+oe FOXP1,P＜0.01）和细胞凋亡（si IRF1+oe FOXP1 vs.si NC+oe FOXP1,P＜0.01）,证明FOXP1通过IRF1造成了以上生物学效应。3.IRF1对胰腺癌细胞CDK2表达以及细胞增殖相关生物学行为的影响:IRF1过表达显著促进了PANC1和SW1990细胞CDK2蛋白表达（P＜0.01）,同时显著抑制了细胞增殖、导致细胞周期G1期阻滞和并促进细胞凋亡（P＜0.01）。裸鼠皮下瘤免疫组化染色表明FOXP1过表达组CDK2蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0.01）。（三）FOXP1通过与IRF1启动子区特定序列结合激活其转录1.通过JASPAR网站预测FOXP1在IRF1启动子区的结合位点,位点1位于-717-702,位点2位于-552-540;在PANC1细胞中进行Ch IP-PCR和Ch IP-q PCR实验,表明FOXP1与两个位点都有结合,但主要与位点1结合（P＜0.01）;双萤光素酶报告基因实验表明,结合位点1突变型启动子完全丧失了应答于FOXP1并激活下游基因转录的能力（p＞0.05）,结合位点2突变型启动子部分丧失了应答于FOXP1并激活下游基因转录的能力（P＜0.01）,进一步表明两个位点对于FOXP1转录激活IRF1都很重要,但位点1更为重要。结论:1.FOXP1在胰腺癌中起抑癌作用,并影响肿瘤的生长与预后。2.FOXP1通过调控IRF1,进而影响胰腺癌的增殖凋亡等生物学行为。3.FOXP1主要与IRF1启动子区域的-717-702位点和-552-540位点结合,进而激活IRF1的转录。