HIV-1感染经ART治疗患者血浆外泌体WNT信号通路mRNA差异表达分析及关键性分子验证

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目的:研究HIV-1感染经ART治疗患者血浆外泌体WNT信号通路m RNA差异表达,对比分析HIV-1感染经ART治疗患者与健康对照者血浆外泌体WNT信号通路m RNA的表达,了解HIV-1感染经ART治疗患者血浆外泌体WNT信号通路相关调控基因和相关功能基因种类、数量变化规律,寻找具有特征性的差异分子,为早诊断、早治疗、清除病毒储存库在内的多种策略提供侯选指标,为了解和早日攻克艾滋病以及其它相关联疾病的研究工作提供理论及实验方面的基础和依据。方法:收集HIV-1感染经ART治疗患者(HIV病毒载量<20拷贝/毫升,CD4+T细胞数量>350个/微升)以及健康对照者血浆各12例。使用QIAGEN外泌体提取试剂盒以及蔗糖垫超高速离心法提取血浆外泌体,通过(i)透射电子显微镜的高分辨率识别外泌体的特征形态;(ii)蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标志物蛋白;(iii)纳米颗粒追踪分析确定外泌体颗粒粒径大小分布情况和整体浓度;对比分析外泌体提取情况,为后续实验中外泌体提取方案的选择提供依据。使用高通量m RNA测序,检测HIV-1感染经ART治疗组和健康对照组血浆外泌体m RNA的表达情况。运用Real-time PCR验证生物信息学分析结果中血浆外泌体WNT信号通路差异表达因子。结果:QIAGEN外泌体提取试剂盒以及蔗糖垫超高速离心法所提取外泌体均符合外泌体特征;高通量m RNA测序结果表明基因表达量共有20308个,在这些表达基因中,HIV-1感染经ART治疗组相对于健康对照组上调表达基因14727个,下调表达基因5581个,主要涉及溶酶体、TNF信号通路、核糖核酸运输、WNT信号通路、结核、NLR信号通路、RIG-I样受体信号通路、原发性免疫缺陷、ECM-受体相互作用等;通过生物信息学软件筛选出142个WNT信号通路的m RNAs表达,其中11个WNT信号通路m RNAs差异表达(DVL2、CREBBP、CAMK2B、TBL1X、MAPK10、INVS、SERPINF1、PRICKLE1、WNT4、AXIN2、CSNK1E),随后采用Real-time PCR检测HIV-1感染经ART治疗组和健康对照组11个血浆外泌体WNT信号通路m RNAs,验证其表达差异。相对定量法2-ΔΔCt公式用于健康对照组和HIV-1感染经ART治疗组血浆外泌体WNT信号通路m RNA的相对表达量计算,血浆外泌体WNT m RNA的表达量以健康对照血浆外泌体WNT m RNA表达量作为标准,和HIV-1感染经ART治疗组血浆外泌体WNT m RNA的相对表达量进行比较,经过统计软件分析,以P值大于0.05表示两组间相对表达量差异无统计学意义,我们发现除SERPINF1外,其余十个血浆外泌体WNT信号通路m RNAs在健康对照组与HIV-1感染经ART治疗组中相对表达量差异都具有统计学意义,P值均小于0.05,且HIV-1感染经ART治疗组相对表达量较健康对照组均升高。结论:HIV-1感染经ART治疗组与健康对照组11个血浆外泌体WNT信号通路差异表达m RNAs除SERPINF1外,DVL2、CREBBP、CAMK2B、TBL1X、MAPK10、INVS、SERPINF1、PRICKLE1、WNT4、AXIN2、CSNK1E在两组间差异均具有统计学意义,并且以上十个血浆外泌体WNT信号通路差异表达m RNAs在HIV-1感染经ART治疗组中相对表达量均高于健康对照组。WNT4 m RNA在HIV-1感染经ART治疗组的表达高于未感染健康对照组,而在早期研究HIV-1感染者(未经治疗)与未感染者的外周血WNTs的表达情况(包括WNT1—WNT16共19个基因)中,WNT4 m RNA在HIV-1感染未经治疗组表达低于未感染组,且WNT4 m RNA表达量随CD4+T细胞数量增加而上升,随病毒载量增加而下降。因此,HIV-1感染来源的血浆外泌体WNT4有进一步研究的价值,有望能够为艾滋病防治建立一种新的策略方向。
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