目的:利用生物转化法高效定向催化原人参三醇型皂苷C24-C25位双键水合生成稀有的25-OH衍生物,并在不同反应阶段选取真菌样品进行转录组测序,进而对差异表达基因/转录本进行系统分析。结合转化产物定量分析技术,挖掘参与人参皂苷水合反应的潜在关键酶,为定向催化工程菌的开发提供理论依据。方法:在前期研究发现的基础上,以原人参三醇型皂苷Rg₁为底物示范,采用单因素考察法筛选真菌D生物转化PPT型人参皂苷的最佳诱导因子和底物浓度。利用HPLC-IT-TOF-MS/MS和HPLC-QQQ-MS/MS技术分别对PPT型人参皂苷的生物催化过程进行定性和定量分析,并使用制备液相纯化目标产物,通过¹³C-NMR技术验证产物化学结构,最终结合时程实验确定人参皂苷结构修饰中间体及产物的转化途径,计算目标产物的转化率;进而通过全长转录组测序技术对不同诱导阶段下真菌D的差异表达基因/转录本进行分析,锁定候选水合酶基因。结果:真菌D转化PPT型人参皂苷的最佳诱导因子为FeSO₄,最佳底物浓度为1.2g/L,转化培养基的最终组成为:20g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵和1mM的FeSO₄;在此条件下对不同PPT型人参皂苷进行转化,结果表明人参皂苷Rg₁的转化途径为:Rg₁→20（S/R）-Rh₁→25-OH-（S/R）-Rh₁,其中转化产物的转化率分别为:7.3%20（S）-Rh₁、6.7%20（R）-Rh₁、43.2%25-OH-20（S）-Rh₁和39.3%25-OH-20（R）-Rh₁;人参皂苷Re的转化途径为:Re→20（S/R）-Rg₂→20（S/R）-Rf₂,转化率分别为:8.8%20（S）-Rg₂、5.8%20（R）-Rg₂、46.8%20（S）-Rf₂、36.3%20（R）-Rf₂;人参皂苷Rf的转化途径为:Rf→25-OH-Rf,转化产物25-OH-Rf的转化率为85.5%;人参皂苷Rg2的转化途径为:20（S/R）-Rg2→20（S/R）-Rf2,转化率分别为:83.8%20（S）-Rf₂、53.8%20（R）-Rf₂;人参皂苷Rh₁的转化途径为:20（S/R）-Rh₁→25-OH-20（S/R）-Rh₁,转化率分别为:70.2%20（S）-Rh₁、46.2%20（R）-Rh₁;其中人参皂苷20（S）-Rf₂和25-OH-20（S/R）-Rf是3个首次得到分离和鉴定的新化合物。通过分析真菌D对不同PPT型皂苷的转化产物含量变化,我们总结了该生物催化系统的作用特点:（1）该催化体系可以专属性的水合PPT型皂苷的C24-C25双键,对PPD型皂苷没有作用;（2）20位的糖基对该水合反应有空间阻碍作用,需要水解糖苷键之后才能进行;（3）极性较大的皂苷,其25-OH衍生物的转化率较高;（4）20-S构型的皂苷,其25-OH衍生物的转化率较高。差异转录组学分析表明,与空白培养物相比,加入皂苷底物进行诱导的真菌D转录本中发生表达变化的水合酶主要有3个,其中与25-OH衍生物含量变化趋势相符的是磷酸丙酮酸水合酶（phosphopyruvate hydratase E.C.4.2.1.11）;转录本中发生表达变化的糖苷水解酶主要有3个,在加入PPT型皂苷诱导之后,唯一呈现表达量上调的潜在水解酶是NAD-dependent epimerase/dehydratase,其变化曲线的上升趋势与人参皂苷Re和Rg₁向Rg₂和Rh₁转化的进程相符,因此我们推测该水解酶可能是负责PPT型皂苷C20位糖苷键水解的关键酶。结论:真菌D是一种非常有潜力的人参皂苷结构修饰菌种,在适宜的条件诱导下它可以分别产生不同的催化反应。在本论文中发现,真菌D可以定向水合PPT型人参皂苷C24-C25双键生成25-OH衍生物,通过条件优化,可以极大的提高该反应的效率和选择性,降低副反应的发生,生成化学背景简单的发酵产物,利于目标产物的分离与纯化,该反应可以作为一种人参皂苷系列25-OH衍生物制备和新化合物挖掘的有力手段。同时,利用转录组学技术对该催化过程中酶基因的表达变化进行追踪,极大的提高了目标酶的发掘成功率,也为后续阐明该反应的底物选择性与催化机理提供了大量理论依据。