【目的】二氢杨梅素是中药枳椇子的主要活性成分之一,其化学式为3,5,7,3′,4′,5′-六羟基2,3-二氢黄酮醇(Dihydromyricetin;DHM),又名蛇葡萄素、双氢杨梅素,是一种黄酮类化合物。既往实验研究证实DHM具有显著抑制肝细胞脂肪变性的药理效应,但其防治酒精性脂肪肝病的分子机制尚未阐明。因此,我们基于已有文献报道,通过RNA-seq转录组学技术进一步深入研究二氢杨梅素防治酒精性脂肪肝的分子机制。【方法】1、体外细胞实验:使用50 m M无水乙醇刺激AML12小鼠肝细胞株建立酒精性脂肪肝细胞模型。通过CCK-8细胞活力实验检测DHM对细胞的毒性浓度范围;通过Nile Red细胞脂肪荧光染色方法观察肝细胞脂肪变性程度;通过q RT-PCR技术检测脂肪酸合成相关基因脂肪酸合成酶乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸氧化有关的基因过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)、脂肪酸转位酶CD36基因以及酒精代谢酶细胞色素P4502e1(CYP2e1)的表达情况,探讨DHM对酒精刺激AML12肝细胞脂肪变性的抑制作用及可能的分子机制。2、体内动物实验:正常C57小鼠给予喂食含5%乙醇的Lieber-De Carli液体饲料10天,诱导小鼠生成AFLD模型,同时设置DHM平行给药组。通过测定肝脏病理切片、血清谷丙转氨酶(ALT)、血清谷草转氨酶(AST)、总甘油三酯(TG)等指标判定肝脏损伤及脂肪变性程度;通过转录组RNA测序(RNA-seq)技术和KEGG数据库,根据差异表达基因功能分类和相关信号通路,探讨DHM防治小鼠酒精性脂肪肝的分子机制。【结果】1、体外细胞实验:(1)CCK8结果显示,100μM浓度以下的DHM对AML12小鼠肝细胞无细胞毒性。(2)Nile Red脂肪染色显示,与正常组相比,50m M酒精刺激的模型组细胞内脂肪生成显著增加;与模型组相比,DHM组脂肪生成明显减少。说明DHM能够抑制酒精诱导的肝细胞脂肪变性。(3)q RT-PCR技术检测结果显示:与正常组相比,模型组中脂肪酸合成相关基因ACC表达升高,脂肪酸氧化有关的基因PPARα表达下降,脂肪酸转运相关基因CD36表达上升,以及酒精代谢相关基因CYP2e1表达增加;与模型组相比加入DHM后,会明显抑制酒精引起的ACC、CD36、CYP2e1基因表达增加,会促进PPARα表达增加,表明DHM可以抑制酒精诱导的肝细胞内的脂肪酸合成和脂肪酸转运,并且能够促进脂肪酸氧化。2、动物体内实验:(1)小鼠肝组织H&E染色结果显示:与正常组相比,模型组小鼠肝组织细胞脂肪变性程度明显加重;与模型组相比,DHM用药组小鼠肝组织细胞脂肪变性呈浓度依赖性减轻,表明DHM能够有效治疗小鼠酒精引起的肝脏脂肪变性。(2)小鼠血清生化检测结果显示:与正常组相比,模型组小鼠肝血清中ALT、AST、TG均明显升高;与模型组相比,DHM用药组小鼠血清中ALT、AST、TG均明显下降。表明DHM能够减轻酒精引起的肝脏损伤和肝细胞脂肪变性。(3)小鼠肝组织RNA-seq转录组学检测分析表明,DHM通过促进PPARα信号通路下游基因Ehhadh、CYP4a10、CYP4a14、CYP4a31和CYP4a32的表达,促进肝脏中的脂肪酸氧化降解,从而起到防治酒精性脂肪肝的药理效应。【结论】DHM具有防治酒精性脂肪肝的作用,其分子机制是通过上调PPARα信号通路中的Ehhadh、CYP4a10、CYP4a14、CYP4a31、CYP4a32基因表达,促进脂肪酸氧化,从而抑制由酒精刺激引起的肝细胞内脂肪变性。