辛伐他汀诱导鼻咽癌细胞凋亡的实验研究

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【目的】  本研究以人鼻咽癌细胞株CNE-1(高分化细胞)、6-10B(低分化细胞)作为研究对象,探讨辛伐他汀(Simvastatin,Sim)对细胞活力和凋亡的影响,并进一步分析辛伐他汀介导的鼻咽癌细胞的凋亡途径及凋亡机制,从而为辛伐他汀的进一步机制研究奠定理论基础。  【方法】  1. 应用CCK-8法研究不同浓度的辛伐他汀处理鼻咽癌细胞24h、48h和72h后的增殖情况,计算存活率,然后选取低、高两个药物浓度作为后续实验。  2.采用 annexinV-FITC/PI 试剂盒中的荧光探针,通过流式细胞术(Flow cytometry(FCM))检测不同药物浓度(对照组,低浓度组,高浓度组)的辛伐他汀作用鼻咽癌细胞48h后细胞发生凋亡的情况。  3.运用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,通过流式细胞术检测不同药物浓度(对照组,低浓度组,高浓度组)的辛伐他汀作用鼻咽癌细胞6h后线粒体活性,了解辛伐他汀介导的鼻咽癌细胞的凋亡途径。  4.利用 DCFH-DA 标记细胞内活性氧的方法,通过流式细胞术检测不同药物浓度(对照组,低浓度组,高浓度组)的辛伐他汀作用鼻咽癌细胞6h后细胞内活性氧成分的变化,进一步了解辛伐他汀介导的鼻咽癌的凋亡途径。  5.采用 annexin-V/PI 试剂盒中的荧光探针,通过流式细胞术检测不同处理组(对照组,对照组+NAC(抗氧化剂),低浓度组,低浓度组+(NAC),高浓度组,高浓度组+(NAC))的辛伐他汀作用鼻咽癌细胞 48h 后细胞发生凋亡的情况。  6. 应用Western blot检测不同药物浓度(对照组,低浓度组,高浓度组)的辛伐他汀作用鼻咽癌细胞48h后?-H2AX蛋白表达的变化。  【结果】  1. CCK-8实验显示0,2,4,8和16μg/ml辛伐他汀作用人鼻咽癌CNE-1、6-10B细胞24h、48h和72h后,可见细胞的增值受到抑制,细胞活力下降,呈剂量和时间依赖性。当4μg/ml的辛伐他汀作用鼻咽癌CNE-1和6-10B细胞48h后,相比对照组,细胞的存活率分别为 59.33%、68.79%(p<0.05)。当 8μg/ml 的辛伐他汀作用72h后,细胞的抑制率分别达到90%、70%以上。  2. FCM 检测结果显示,与对照组相比,辛伐他汀作用人鼻咽癌 CNE-1 和6-10B细胞48h后,细胞凋亡率增加,呈浓度依赖性(p<0.05)。当高浓度8μg/ml辛伐他汀作用CNE-1和6-10B细胞48h后其凋亡率分别为32.3%、36.4%。  3. 线粒体膜电位(MMP)采用JC-1染色检测。按照试剂盒说明书,我们发现,相比对照组,低浓度组(4μg/ml)和高浓度组(8μg/ml)辛伐他汀作用鼻咽癌细胞6h后MMP的变化没有统计学差异(p>0.05)。  4. 活性氧(ROS)通过ROS检测试剂盒及流式细胞术来检测。相比对照组,低浓度组(4μg/ml)和高浓度组(8μg/ml)辛伐他汀作用鼻咽癌细胞6h后细胞内活性氧成分的变化没有统计学差异(p>0.05)。  5. Flow cytometry(FCM)检测结果显示,对照组与对照组+NAC(抗氧化剂)组,低浓度组与低浓度+NAC组,高浓度组与高浓度+NAC组之间的凋亡率没有统计学差异(p>0.05)。  6. Western blot检测结果显示,与对照组相比,辛伐他汀作用人鼻咽癌CNE-1和6-10B细胞48h后,?-H2AX蛋白表达量增加,呈剂量依赖性,对照组、低浓度组和高浓度组间差异具有统计学意义(p<0.05)。  【结论】  辛伐他汀可以抑制鼻咽癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡;而且可能通过诱导DNA双链断裂发挥诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用。
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