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脂肪诱导转录物(FIT)和Lipin都是与脂肪代谢有关的基因,FIT是对脂肪组装成脂滴起关键作用的基因,是内质网膜蛋白,参与脂类代谢的氧化作用。Lipin是一种关键的脂肪调节酶,作为蛋白质在哺乳动物细胞中调节脂肪代谢。为了研究Lipin和FIT蛋白的生物学功能,本试验以EST片段为基础,利用同源序列克隆原理设计引物,对猪各种组织提取的总RNA进行RT-PCR,通过RT-PCR技术克隆得到FIT(FIT1和FIT2)和Lipin(Lipin1,2和3)的cDNA序列,利用生物信息学工具预测其相关生物学性质,并对其组织进行分布初探,试验分两个系列。一、猪Lipin蛋白家族的克隆和组织分布Lipin1基因包含一个完整的开放阅读框架(open reading frame, ORF)为2-2686bp,全长为2692bp,由894个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为189个,碱性氨基酸为122个,分子量为98.91kDa,等电点为6.40。结构域预测含有LNS2结构域,位置在678-834aa,核定位NLS预测含有“KKRRKRRRK”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin1基因与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为82.8%、85.0%、82.8%,预测的氨基酸序列与小鼠、人和大鼠的同源性分别为88.8%、89.9%和88.7%。Lipin2基因全长为2693bp,ORF为11-2686bp,由891个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为190个,碱性氨基酸为126个,分子量为98.89kDa,等电点为5.32。LNS2结构域位置在680-836aa,核定位NLS预测含有“KKKKRRRKK”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin2基因与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为83.0%、86.7%、82.9%,预测的氨基酸序列的同源性分别为87.4%、90.3%和87.4%。Lipin3基因变体1全长为2872bp,ORF为149-2728bp,由859个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为165个,碱性氨基酸为105个,分子量为93.59kDa,等电点为5.42。LNS2结构域位置在648-804aa,核定位NLS预测含有“KKKRRRRKPRRKE”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,Lipin3基因变体1与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为75.6%、83.4%、78.6%,预测的氨基酸序列的同源性分别为75.9%、81.6%和77.4%。变体2全长为2848bp,ORF为149-2704bp,由851个氨基酸残基组成,其中酸性氨基酸为163个,碱性氨基酸为104个,分子量为92.74kDa,等电点为5.42。LNS2结构域位置在640-796aa,核定位NLS预测含有“KKKRRRRKPRRKE”结构,含有HAD-样结构域“DIDGT”催化模序,变体2与小鼠、人和大鼠的cDNA序列同源性分别为75.6%、83.2%、78.5%,预测的氨基酸序列的同源性分别为76%、80.9%和77.4%。组织分布结果显示:Lipin1在脾、肺、肾、膀胱、大脑、小脑、胃、空肠、肌肉和脂肪等多种组织中都有分布,而Lipin2和Lipin3仅在脾、肺、回肠和肌肉中有分布。二、猪FIT蛋白家族的克隆和组织分布利用同源序列克隆原理设计克隆引物,对猪各种组织提取的总RNA进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化Ecol.JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析,克隆的猪FIT1基因包含完整的开放阅读框架,长为1310bp,ORF为400-1272bp,编码290个氨基酸,其中酸性氨基酸为22个,碱性氨基酸为39个,分子量为32.17kDa,等电点为10.47,信号肽为1~35aa,含有6个跨膜结构域。猪FIT1的核酸序列与人、牛、大鼠和小鼠的同源性分别为92.1%、93.2%、87.4%和88.1%,氨基酸序列的同源性分别为97.2%、96.6%、94.8%和95.5% ,为进一步研究FIT1的生物学功能奠定了基础。克隆的猪FIT2基因包含完整的开放阅读框架,长为1776bp,ORF为82-870bp,编码262个氨基酸,其中酸性氨基酸为28个,碱性氨基酸为31个,分子量为29.64kDa,等电点为8.91,信号肽为1~30aa,含有4个跨膜结构域。FIT2的核酸序列与小鼠、大鼠和人的同源性分别为85.0%、85.7%和88.1%,氨基酸序列的同源性分别为87.4%、87.4%和92.0%,为进一步研究FIT2的生物学功能奠定了基础。组织分布结果显示:FIT1主要在肌肉和脂肪组织有分布,其它组织分布量太低,而FIT2在心、肝、脾、肾、大脑、小脑、空肠、回肠、甲状腺、肌肉和脂肪等组织都有分布。