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芽休眠的特性能使植物免于低温伤害安全越冬，也能使果树来年正常开花结果。广义的休眠通常分为类休眠、内休眠和生态休眠，狭义的休眠则特指内休眠（本文所指）。随着秋季日照变短，气温降低，果树逐步进入休眠，经过一定时长的低温积累，休眠得以解除。解除休眠所需的有效低温积累时数称为“需冷量”。需冷量因种类和品种而不同，是果树引种和设施栽培中必须考虑的问题。随着全球气候变暖，许多果树产区都出现了果树需冷量无法满足的现象，严重影响产量。梨是我国第三大果树，但针对梨芽休眠的研究相对较少。梨芽休眠维持和解除的研究有助于阐明不同品种间产生需冷量差异的原因，丰富木本植物芽休眠调控机制的理论，也为培育低需冷量新品种梨提供理论指导。
脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是目前公认的休眠维持和解除过程中关键的两种植物激素，但这两种激素具体是如何作用于休眠过程的，至今仍然没有一个明确的答案。DAM/SVP作为调控休眠的关键转录因子，已经得到了广泛的研究，但在休眠维持过程中，ABA如何促进DAM的表达仍然缺乏研究。本论文通过对ABA和GA在休眠维持和解除过程中的拮抗作用进行分析，进一步明确了ABA促进休眠维持、GA促进解除的分子机制。同时，研究鉴定出了维持梨芽休眠的关键转录因子PpyABF3能够响应ABA，并且能够通过招募COMPASS-like复合体参与H3K4me3组蛋白修饰调控下游靶基因的表达。主要研究结果如下：
1）初步阐明了PpyGAST1整合ABA信号和GA合成促进休眠解除的分子机制。研究以‘砀山酥梨’侧花芽为试材，测定了休眠过程中花芽内各类GA的含量，并利用外源GA4+7处理，确认了GA在休眠解除过程中发挥作用。通过对休眠期间的转录组分析，结合qRT-PCR分析，我们找出了可能调控休眠的关键基因PpyGAST1，并对GAST基因家族进行了分析，检测了不同成员在休眠过程中的表达模式。在拟南芥中过表达PpyGAST1能够促进拟南芥种子萌发，同时，AtGA20ox2和AtGA3ox1在过表达PpyGAST1的拟南芥中显著上调，AtEXPA1的表达也同样上调。利用GA合成抑制剂多效唑（PAC）处理拟南芥种子之后，我们发现即使PpyGAST1过表达也不能促进种子萌发，这意味着PpyGAST1需要通过GA合成发挥作用。通过梨芽休眠过程中的切片以及PpyEXPA1的表达分析，我们发现PpyEXPA1的表达与休眠解除时细胞分裂膨大相关，并且与PpyGAST1的表达趋势类似。
2）研究鉴定出了一个响应ABA的关键转录因子PpyABF3，能够通过促进PpyDAM3的表达促进梨芽休眠的维持。利用ABA合成抑制剂氟啶酮（FLU）以及外源ABA处理‘砀山酥梨’花芽，我们明确了ABA能够使梨花芽维持休眠的状态。FLU处理休眠期的‘砀山酥梨’枝条后，在花芽中调控休眠的关键转录因子PpyDAM3表达下调，萌芽率提高。CYP707A是降解ABA的关键酶，在过表达PpyCYP707A3的梨愈伤组织中PcDAM3的表达显著下调，进一步说明DAM基因的表达确实受到内源ABA的调控。通过表达模式分析，我们找到了一个bZIP家族基因ABRE-BINDING FORTER3（PpyABF3），在休眠过程中的表达模式与PpyDAM3类似。一系列生化实验证明PpyABF3能够与PpyDAM3启动子的第二个ABRE元件结合，并且激活PpyDAM3的表达。在梨愈伤组织中过表达PpyABF3能够显著提高PcDAM3的表达，过表达PpyABF3和PpyDAM3的梨愈伤组织都表现出生长缓慢的表型。我们在梨中又鉴定出另一个ABF蛋白PpyABF2，能够与PpyABF3蛋白结合，并干扰PpyABF3对PpyDAM3启动子的结合和激活，表明DAM基因的表达会受到精密调控。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术将休眠芽中PpyABF3和PpyDAM3沉默之后，能够显著提高其萌芽率，促进休眠解除。
3）提出了PpyABF3通过招募COMPASS-like复合体促进下游基因H3K4me3富集从而促进基因表达的调控模型。由于PpyABF3是一个典型的bZIP转录因子，因此我们以休眠期间的cDNA构建酵母AD文库，利用PpyABF3蛋白进行了酵母双杂交文库筛选。从筛库结果中，我们验证了PpyABF3能够与PpyWDR5a互作，而WDR5a是COMPASS-like复合体的核心成员，负责特异性识别组蛋白H3K4并进行三甲基化修饰，这意味着PpyABF3可能还参与了H3K4me3组蛋白修饰过程，调控下游基因的表达。我们利用过表达PpyABF3的梨愈伤组织进行组蛋白H3K4me3的ChIP-qPCR实验，结果表明，过表达PpyABF3能够增加PcDAM3和PcGA2OX1转录起始位点附近H3K4me3的富集，说明PpyABF3确实能够促进靶基因附近H3K4me3组蛋白修饰的富集，从而调控靶基因的表达。利用VIGS技术将PpyGA2OX1沉默，同样能够提高‘砀山酥梨’芽的萌发率，促进休眠解除。
综上，本研究针对ABA与GA的拮抗关系展开研究，构建了以ABA信号通路关键转录因子PpyABF3为中心的休眠维持和解除过程中的调控网络，提出了休眠-生长周期中ABA如何与GA拮抗并维持休眠状态的分子机制，能够与DAM为中心的调控网络相互补充，使得休眠的调控更为清晰，并为分子育种提供了潜在的靶基因，为寻找和开发新型低毒破眠剂提供了理论支撑。
脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）是目前公认的休眠维持和解除过程中关键的两种植物激素，但这两种激素具体是如何作用于休眠过程的，至今仍然没有一个明确的答案。DAM/SVP作为调控休眠的关键转录因子，已经得到了广泛的研究，但在休眠维持过程中，ABA如何促进DAM的表达仍然缺乏研究。本论文通过对ABA和GA在休眠维持和解除过程中的拮抗作用进行分析，进一步明确了ABA促进休眠维持、GA促进解除的分子机制。同时，研究鉴定出了维持梨芽休眠的关键转录因子PpyABF3能够响应ABA，并且能够通过招募COMPASS-like复合体参与H3K4me3组蛋白修饰调控下游靶基因的表达。主要研究结果如下：
1）初步阐明了PpyGAST1整合ABA信号和GA合成促进休眠解除的分子机制。研究以‘砀山酥梨’侧花芽为试材，测定了休眠过程中花芽内各类GA的含量，并利用外源GA4+7处理，确认了GA在休眠解除过程中发挥作用。通过对休眠期间的转录组分析，结合qRT-PCR分析，我们找出了可能调控休眠的关键基因PpyGAST1，并对GAST基因家族进行了分析，检测了不同成员在休眠过程中的表达模式。在拟南芥中过表达PpyGAST1能够促进拟南芥种子萌发，同时，AtGA20ox2和AtGA3ox1在过表达PpyGAST1的拟南芥中显著上调，AtEXPA1的表达也同样上调。利用GA合成抑制剂多效唑（PAC）处理拟南芥种子之后，我们发现即使PpyGAST1过表达也不能促进种子萌发，这意味着PpyGAST1需要通过GA合成发挥作用。通过梨芽休眠过程中的切片以及PpyEXPA1的表达分析，我们发现PpyEXPA1的表达与休眠解除时细胞分裂膨大相关，并且与PpyGAST1的表达趋势类似。
2）研究鉴定出了一个响应ABA的关键转录因子PpyABF3，能够通过促进PpyDAM3的表达促进梨芽休眠的维持。利用ABA合成抑制剂氟啶酮（FLU）以及外源ABA处理‘砀山酥梨’花芽，我们明确了ABA能够使梨花芽维持休眠的状态。FLU处理休眠期的‘砀山酥梨’枝条后，在花芽中调控休眠的关键转录因子PpyDAM3表达下调，萌芽率提高。CYP707A是降解ABA的关键酶，在过表达PpyCYP707A3的梨愈伤组织中PcDAM3的表达显著下调，进一步说明DAM基因的表达确实受到内源ABA的调控。通过表达模式分析，我们找到了一个bZIP家族基因ABRE-BINDING FORTER3（PpyABF3），在休眠过程中的表达模式与PpyDAM3类似。一系列生化实验证明PpyABF3能够与PpyDAM3启动子的第二个ABRE元件结合，并且激活PpyDAM3的表达。在梨愈伤组织中过表达PpyABF3能够显著提高PcDAM3的表达，过表达PpyABF3和PpyDAM3的梨愈伤组织都表现出生长缓慢的表型。我们在梨中又鉴定出另一个ABF蛋白PpyABF2，能够与PpyABF3蛋白结合，并干扰PpyABF3对PpyDAM3启动子的结合和激活，表明DAM基因的表达会受到精密调控。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术将休眠芽中PpyABF3和PpyDAM3沉默之后，能够显著提高其萌芽率，促进休眠解除。
3）提出了PpyABF3通过招募COMPASS-like复合体促进下游基因H3K4me3富集从而促进基因表达的调控模型。由于PpyABF3是一个典型的bZIP转录因子，因此我们以休眠期间的cDNA构建酵母AD文库，利用PpyABF3蛋白进行了酵母双杂交文库筛选。从筛库结果中，我们验证了PpyABF3能够与PpyWDR5a互作，而WDR5a是COMPASS-like复合体的核心成员，负责特异性识别组蛋白H3K4并进行三甲基化修饰，这意味着PpyABF3可能还参与了H3K4me3组蛋白修饰过程，调控下游基因的表达。我们利用过表达PpyABF3的梨愈伤组织进行组蛋白H3K4me3的ChIP-qPCR实验，结果表明，过表达PpyABF3能够增加PcDAM3和PcGA2OX1转录起始位点附近H3K4me3的富集，说明PpyABF3确实能够促进靶基因附近H3K4me3组蛋白修饰的富集，从而调控靶基因的表达。利用VIGS技术将PpyGA2OX1沉默，同样能够提高‘砀山酥梨’芽的萌发率，促进休眠解除。
综上，本研究针对ABA与GA的拮抗关系展开研究，构建了以ABA信号通路关键转录因子PpyABF3为中心的休眠维持和解除过程中的调控网络，提出了休眠-生长周期中ABA如何与GA拮抗并维持休眠状态的分子机制，能够与DAM为中心的调控网络相互补充，使得休眠的调控更为清晰，并为分子育种提供了潜在的靶基因，为寻找和开发新型低毒破眠剂提供了理论支撑。