射血分数保留型心力衰竭（Heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF）是心室舒张功能障碍,心搏量减少,而心室收缩功能正常或轻度受损,左室射血分数尚处于正常范围内的一种心力衰竭。其高发病率和高死亡率成为目前最具挑战性的临床综合征之一。然而,以慢性心衰常规治疗方式如β受体阻滞剂、RAAS系统拮抗剂、醛固酮拮抗剂均不能有效降低其住院率及死亡率。现代医学尚未对HFpEF的发病机制形成统一定论,心脏重塑为其重要病理改变。脉络学说对血管病变防治具有重要指导价值,指出“络息心积”中医病机特点与HFpEF心脏重塑机制高度相关,提出气阳虚乏、痰瘀互结、水饮内停导致的“气、血、水”异常为基本病机,脉络阻滞日久引起心脏组织肥厚,最终导致络息心积的病理变化。脉络学说指导HFpEF防治,提出“气血水同治分消”治则,确立“益气温阳、活血通络、利水消肿”治法,研制芪苈强心胶囊,研究显示对临床HFpEF患者心功能、6 min步行距离、二尖瓣舒张早期最大的流速E峰与舒张晚期最大的流速A峰（E/A）均有确切改善。本研究应用醋酸脱氧皮质酮（Deoxycortone Acetate,DOCA）-盐敏感大鼠构建HFpEF模型,探讨芪苈强心胶囊对HFpEF的药效作用;同时,为明确芪苈强心发挥药效的物质基础,采用相同模型探讨其活性成分杠柳毒苷对DOCA模型大鼠的治疗作用;再通过网络药理学分析和转录组—蛋白组—代谢组的“贯穿组学”研究探讨芪苈强心潜在作用机制,为临床治疗HFpEF提供新的治疗途径和有效药物选择。第一部分芪苈强心胶囊及其有效成分对DOCA盐敏感型HFpEF大鼠药效作用研究目的:探讨芪苈强心胶囊及杠柳毒苷对慢性心力衰竭大鼠心功能、结构性重构及电生理重构的影响,明确芪苈强心治疗HFpEF的药效学基础及可能发挥作用的活性成分。方法:雄性SD大鼠单肾切除并注射醋酸脱氧皮质酮,成模的60只大鼠随机分为4组:模型组、对照组（沙库巴曲缬沙坦20 mg/kg）、芪苈-低组、芪苈-高组（芪苈强心药粉0.25 g/kg,1 g/kg）,每组各15只,另设正常对照组（n=10）。观测血压、N端脑钠肽前体（N-terminal pro-B type natriuretic peptide,NT-pro BNP）、心脏指数,超声心动图和血流动力学测量心室舒张功能及室壁肥厚程度,Masson染色观测心肌纤维化程度,WGA染色观测心肌细胞横截面积,Western blot检测心肌组织基质金属蛋白酶2（Matrix Metallopeptidase 2,MMP2）、基质金属蛋白酶9（Matrix Metallopeptidase 9,MMP9）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）、SMAD同源物2（SMAD family member 2,Smad2）,SMAD同源物3（SMAD family member3,Smad3）蛋白表达情况;多因子、流式细胞术检测炎症因子及免疫功能变化;电标测Mapping检测心脏电生理功能。另设45只大鼠,按照上述造模方法分为3组:正常组、模型组、杠柳毒苷组（杠柳毒苷1.5 mg/kg）,同样通过观察血压、心脏指数、超声心动图、血流动力学、病理染色、免疫印迹、多因子、流式细胞术、细胞收缩及离子浓度同步测量方法检测杠柳毒苷对模型大鼠心脏重构和炎症反应的影响。结果:心功能检测显示,与正常组相比,模型组大鼠血压、心脏指数、NT-pro BNP含量明显升高,且出现舒张功能障碍,表现为:E/A比率降低、左室前/后壁（left ventricular anterior/posterior wall,LVAW/LVPW）厚度增高、容舒张时间（Isovolumic relaxation time,IVRT）、舒张时间常数（Tau）延长,舒张末期压力-容积关系（end-diastolic pressure-volume relationship,EDPVR）斜率提升,-d P/dt升高证实了模型HFpEF的舒张功能受损特征,左室顺应性降低;同时,+d P/dt和等容收缩时间（Isovolumic contraction time,LVCT）无改变,射血分数（ejection fraction,EF）≥50%,提示左室收缩功能和射血分数正常。与模型组相比,对照组和芪苈各剂量组可以降低NT-pro-BNP、心脏指数,提高EF、E/A比值（P＜0.05）,缩短IVRT、-d P/dt、Tau时间（P＜0.05）,降低LVAW、LVPW指数（P＜0.05）;对照组血压恢复正常,芪苈各剂量未见降低血压作用。病理染色显示,模型组大鼠胶原沉积（collagen volume fraction,CVF）显著增加,炎性小体渗出较多,同时心肌细胞横截面积（cross-sectional area,CSA）显著增大（P＜0.01）;对照组和芪苈组均能不同程度地预防小鼠心肌纤维化,减轻心肌细胞肥大程度,减少炎性浸润。Western blot结果显示芪苈各剂量组能降低MMP2、MMP9、TGF-β1、NF-κB、Smad2、Smad3蛋白表达量（P＜0.05,P＜0.01）。多因子检测显示,与模型组相比,芪苈-高组细胞间粘附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）明显降低（P＜0.05,IL-1αP＜0.01）,抗炎因子白介素-10（Interleukin-1β,IL-10）、基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1）、白介素-4（Interleukin-4,IL-4）明显升高（P＜0.05）。流式细胞术结果显示,芪苈-高组能提高CD4,降低CD8过表达,并减少促炎Th1细胞因子IFN-γ水平（P＜0.05）,提高抗炎Th2细胞因子IL-4的表达（P＜0.05）,且能提高Treg细胞分布,显著恢复CD11b/c+细胞表达量（P＜0.01）,提示芪苈强心能够启动机体免疫应答,调整心脏适应性免疫。电标测Mapping结果显示,结果可见模型组房室传导时间延长,传导无规律,甚至出现心律失常现象。各给药组能降低房室传导时间,房室之间传导规律趋于正常;但组间传导时间无统计学差异（P＞0.05）。芪苈强心有效成分杠柳毒苷能降低模型大鼠心脏指数、NT-Pro BNP、LVAW和LVPW等心室结构性重构指数（P＜0.05）,缩短IVRT、舒张持续时间、Tau时间以及E/A比值（P＜0.05）提高心脏舒张功能;能够提高心肌细胞收缩及钙瞬变功能（P＜0.05）;通过减少心肌炎性蛋白MMP9、TGF-β1、NF-κB含量,减少血液及脾细胞中炎细胞浸润和调节心脏免疫功能发挥对心脏的保护作用。小结:1.脉络学说指导探讨HFpEF中医病机,提出“气阳虚乏、瘀血阻络、水饮内停”中医病机特点,痰饮瘀血内阻致使“络息心积”的病理改变与心脏重构相吻合;确立“益气温阳、活血通络、利水消肿”的气血水同治分消治疗原则开辟HFpEF治疗新思路。2.芪苈强心能明显抑制HFpEF大鼠向心性肥厚重塑,提高心室舒张功能,改善心肌顺应性;能明显降低HFpEF大鼠心肌纤维化程度,改善心肌僵硬程度,其机制与抗炎及免疫调节作用相关。此外,芪苈强心还能改善房室传导时间,防治心脏电生理重塑。3.芪苈强心有效成分杠柳毒苷改善HFpEF大鼠的心脏重构,提高心肌细胞收缩及钙瞬变功能;同时,杠柳毒苷能通过减少HFpEF大鼠炎细胞浸润和调节心脏免疫功能发挥对心脏的保护作用,是芪苈强心发挥药效的重要活性成分。第二部分基于网络药理学的芪苈强心胶囊治疗HFpEF作用靶点研究目的:应用网络药理学技术,通过将芪苈强心胶囊及HFpEF的共同作用靶点进行网络构建,富集相应分子功能和通路,探讨其发挥治疗作用的药效基础及潜在作用机制方法:将芪苈强心胶囊中已通过标准品对照确定的44个化合物,利用Swisstargetprediction、Pharmmapper平台预测化合物靶点,OMIM、Dis Genet、Gen Card数据库中检索HFpEF疾病靶点,二者取交集,利用STRING数据库和Cytoscape 3.7.2软件进行蛋白互作网络分析（PPI）和拓扑分析。Metescape平台对共同靶点进行基因本体论（Gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。结果:芪苈强心有效成分和HFpEF分别筛选出38个相同作用靶点。GO功能及KEGG通路富集分析得出其在血液循环、循环系统、心脏收缩等生物过程,膜筏、轴突、细胞质区等细胞成分,α-葡萄糖苷酶活性、内肽酶活性、水解酶活性等分子功能上起作用,涉及c GMP-PKG信号通路、肾素分泌、钙信号通路等。小结:本研究基于网络药理学通过构建“药物-有效成分-靶点-疾病”网络,阐明了芪苈强心胶囊“多成分-多靶点-多环节”治疗HFpEF的作用机制。网络构建结果发现芪苈强心胶囊可能通过激活c GMP-PKG信号通路,增强内皮功能,改善心肌被动僵硬程度,增强Ca2+转运功能,减轻心室重构,为下一步实验研究奠定了研究基础和有利的指导方向。第三部分基于多组学的芪苈强心胶囊治疗HFpEF作用机制研究目的:探究芪苈强心胶囊治疗HFpEF的基因-蛋白质-代谢物生物标志物,寻找其在转录组-蛋白组-代谢组“贯穿组学”层面的生物学基础和作用靶点及关键作用机制,并通过在体实验进行验证。方法:1.高通量转录组测序（RNA-seq）:选择正常组、模型组、芪苈组（高剂量）每组各5只大鼠心脏组织,提取m RNA后通过高通量测序技术获得原始基因和转录本数据,通过基因库比对进行注释。筛选差异基因,并对其进行GO和KEGG富集分析。2.DIA蛋白质组学:选择正常组、模型组、芪苈组（高剂量）每组各8只大鼠,提取心脏组织蛋白后进行酶解并采用同位素相对和绝对定量（Tandem Mass Tag,TMT）标记肽段特异氨基酸位点,再进行LC-MS/MS（串联质谱）鉴定。通过数据库比对,对质谱数据进行蛋白质定性和定量分析,最后对差异表达蛋白进行GO和KEGG富集分析。3.非靶向代谢组学:选择正常组10只、模型组12只、芪苈组（高剂量）13只大鼠,用有机试剂沉淀蛋白法对心脏组织样本进行代谢物提取,采用LC-MS（液相色谱-质谱）、GC-MS（气相色谱-质谱）、NMR（核磁共振）技术分别在正负离子模式下进行质谱扫描检测。利用meta X软件进行代谢物鉴定,利用HMDB、KEGG等数据库进行代谢物注释,定量、筛选差异代谢物后进行KEGG富集分析。4.三组学关联分析:将三个组学中符合治疗趋势的差异基因/蛋白/代谢物所富集到的通路用venn图取交集,利用Pearson相关系数来衡量各组学之间数据集合的线性关系。将三个组学中富集程度较高的c GMP-PKG信号通路中所有的差异基因、差异蛋白和差异代谢物进行通路可视化处理。5.实验验证:Elisa法检测血清一氧化氮（nitric oxide,NO）、环磷酸鸟苷（cyclic guanosinc monophosphate,c GMP）含量;免疫荧光染色观测心肌组织内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）、血小板-内皮细胞粘附分子（cluster of differentiation 31,CD31）荧光表达情况;Western blot检测心肌e NOS、蛋白激酶G1（protein kinase G1,PKG1）、c GMP特异性磷酸二酯酶5（GMP-binding c GMP-specific phosphodiesterase type 5,PDE5A）、心肌肌浆网Ca2+-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA）、可溶性鸟苷酸环化酶α（soluble guanylate cyclaseα,s GCα）蛋白含量;RT-PCR检测心肌B型脑钠肽（B-type brain natriuretic peptide,BNP）、β-肌球蛋白重链（myosin heavy chainβ,β-MHC）的m RNA表达。结果:1.转录组:正常组与模型组共有1410个差异表达基因,与模型组相比芪苈组上调了21个基因,下调了216个基因,合计调整247个基因。三组的差异基因涉及到的生物学功能主要集中在胶原纤维组织、补体激活、线粒体呼吸链、血管生成等方面;KEGG主要富集到补体激活、肥厚性心肌病、c GMP-PKG信号通路、钙信号通路等。2.蛋白组:正常组与模型组共有401个差异表达蛋白,与模型组相比芪苈组上调了29个,下调了4个蛋白,合计调整33个蛋白。三组的差异蛋白涉及到的生物学功能主要集中在线粒体呼吸链、蛋白质折叠、ATP代谢,翻译、心肌收缩等方面;KEGG主要富集到核糖体、内质网中蛋白质加工、糖酵解/糖异生、c GMP-PKG信号通路、心肌收缩等。3.代谢组:正负离子模式下分别鉴定出11388个、11398个一级代谢物,以及789个、1110个二级代谢物。三组鉴定到的代谢产物多集中在脂质和类脂化合物,其次是苯丙烷和聚酮、有机杂环化合物、苯型烃类等。KEGG7大分类主要集中在环境信息过程、人类疾病、代谢过程和组织系统上。其中代谢过程富集到包括糖、脂、氨基酸等多作用途径,包括氧化磷酸化、三羧酸循环、戊糖磷酸途径、甘油酯代谢、氨基酸的生物合成等,环境信息过程一级条目下中再次富集到c GMP-PKG信号通路。4.关联分析得到8条信号通路,分别与调节能量代谢、激素合成方面相关;相关性分析关联出基因组-蛋白组之间共计49个正相关（positive）和13个负相关（negative）关系对,转录-蛋白-代谢三组学之间没有满足阈值标准的关系对;在网络药理学和3个组学的多组比较中均富集到c GMP-PKG信号通路,该通路中存在转录-蛋白-代谢的多方位的调控作用,并做进一步实验验证。5.实验验证:体内实验证实芪苈强心能够提高血清NO、c GMP含量（P＜0.05）,增强心肌e NOS、CD31荧光表达（P＜0.01）,增加e NOS、PKG1、SERCA、s GCα蛋白表达,降低PDE5A蛋白表达（P＜0.05）,减少BNP、β-MHC m RNA表达（P＜0.05）。小结:本部分采用多组学分析方法,从整体角度评价芪苈强心对HFpEF机体生物学网络的影响,揭示药物调控的主要作用靶点,阐明芪苈强心胶囊多组分-多靶点-多环节治疗HFpEF的作用机制。通过体内实验,证实芪苈强心胶囊可以多维度、全面的激活c GMP-PKG信号通路,增强内皮功能,改善心肌被动僵硬程度,增强Ca2+转运功能,减轻心室重构,验证了网络药理学的预测结果。这些数据对于阐明芪苈强心胶囊改善舒张性心功能障碍的潜在机制非常重要,并为HFpEF临床治疗用药提供了有力佐证。结论:1.本研究以脉络学说为指导探讨HFpEF的中医病机,指出气阳虚乏、痰瘀互结、水饮内停导致的“气、血、水”异常为基本病机,脉络阻滞日久引起心脏组织肥厚,最终导致络息心积的病理变化。脉络学说指导下研制的芪苈强心胶囊以“气血水同治分消”为治则,“益气温阳、活血通络、利水消肿”为治法,为HFpEF治疗提供理论基础和干预药物。2.证实芪苈强心胶囊能改善DOCA-盐敏感大鼠左室射血分数和舒张功能,降低血清NT-Pro BNP水平,减轻心室肥厚,显著减轻心脏结构重塑,改善心功能;降低纤维化,显著抑制炎症反应和免疫细胞募集;同时能够改善心脏电生理重构。杠柳毒苷是其发挥药效的重要物质基础。3.利用网络药理学方法,通过构建“芪苈强心活性成分-作用靶点-HFpEF”相互作用网络,揭示了芪苈强心胶囊发挥“多成分-多途径-多靶点”治疗优势,并预测其作用机制可能与c GMP-PKG信号通路有关。4.多组学的分析方法揭示芪苈强心可通过多组分-多靶点-多环节治疗HFpEF的作用机制。通过体内实验,证实芪苈强心胶囊多维度、全面激活c GMP-PKG信号通路,为芪苈强心在治疗HFpEF的临床应用提供了有力的研究证据支持。