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研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是多因素导致的一种系统性、炎症性自身免疫性疾病,主要病理特征包括滑膜炎和骨破坏。骨微环境成破骨细胞失衡、成骨细胞的凋亡和破骨细胞的过度活化是RA骨破坏发生发展的重要环节。因此对骨微环境中成骨细胞（介导骨形成）和破骨细胞（介导骨吸收）之间的动态平衡调节机制进行深入研究,进而找到维持骨微环境成破骨细胞平衡的治疗靶点,对于抑制RA骨破坏具有重要的意义。越来越多的研究证据表明中医药在治疗RA及抑制骨破坏方面具有良好的临床效果,但具体作用机制需进一步明确。课题组前期创新性提出“见骨损而非独责之于肾”,指出“湿热瘀”是活动性RA的核心病机,亦是RA骨破坏的病理关键,针对此核心病机确定的清热利湿活血法是治疗活动性RA的治疗大法,清热活血方是行之有效的中药复方。临床研究表明清热活血方能够降低RA疾病活动度、改善患者生活质量,抑制骨破坏的发生。网络药理学分析表明,清热活血方可以通过多靶点、多通路来发挥治疗RA,抑制骨破坏的作用。由此我们进一步思考,清热活血方抑制RA骨破坏的活性成分是什么?清热活血方对骨微环境的调控机制是什么?如何调节成破骨细胞平衡?近年来不断深入研究的长非编码RNA为解决该问题提供了可能。课题组前期研究发现,在RA患者血清外泌体中miR-214明显上调,清热活血方可以降低miR-214的表达,从而降低疾病活动度,抑制骨破坏。通过生物信息学分析,LncRNAMEG3与miRNA-214的部分序列互补,且ATF4是受miR-214调控的下游靶基因。因此,我们做出以下科学假设:LncRNA MEG3与miR-214互作抑制ATF4的表达,使骨微环境成破骨细胞失衡,导致RA骨破坏发生;清热活血方通过LncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴调节骨微环境成破骨细胞平衡,促进骨形成,减少骨吸收,进而抑制RA骨破坏。第一部分:清热活血方液相色谱质谱分析研究目的通过高效液相色谱技术鉴定分析清热活血方的药效活性成分,明确清热活血方发挥功效的物质基础。研究方法分别精密称取清热活血方各味药材,通过水提法获得滤液,浓缩定容,微孔膜过滤。同时精密称量标准品,制备溶液,微孔膜过滤,将二者注入高效液相色谱仪中检测。采用电喷雾离子源（ESI）,正负离子模式下采集数据,通过对样品溶液和对照品溶液进行比对分析,获取并分析清热活血方基峰离子色谱图。研究结果与标准品比对,从清热活血方中分离出9种活性成分,分别是绿原酸、落新妇苷、苍术素、盐酸小檗碱、芍药苷、丹参酮ⅡA、青藤碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、姜黄素。通过文献复习,清热活血方中的活性成分可以调节成破骨细胞的增殖分化。研究结论一清热活血方具有多种活性成分,可以调节成破骨细胞的增殖分化。第二部分:清热活血方防治CIA大鼠骨破坏的作用及机制研究研究目的研究清热活血方对CIA大鼠骨破坏的干预作用,以lncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴为切入点,阐明清热活血方调节骨微环境成破骨细胞平衡抑制CIA大鼠骨破坏的作用机制。研究方法1构建CIA大鼠模型,分为正常组、模型组、清热活血方低剂量组（8.5g/kg）、清热活血方中剂量组（17g/kg）、清热活血方高剂量组（34g/kg）以及甲氨蝶呤组（0.2mg/kg）。通过测量大鼠体重、足趾容积、关节炎临床积分,踝关节病理片、踝膝关节Micro-CT来评估清热活血方对CIA大鼠骨破坏的干预作用,通过肝肾病理评估清热活血方的安全性。2采用ELISA检测大鼠血清IL-6、TNF-α的含量;采用RT-qPCR检测大鼠骨组织LncRNAMEG3、miR-214、ATF4及骨形成、骨吸收标志物mRNA的表达情况。研究结果1大鼠一般情况:与模型组相比,清热活血方不同剂量组及MTX组大鼠一般情况均有改善;清热活血方不同剂量组及MTX组大鼠体重增加较快（p＜0.05）,造模7天后,足趾容积增加缓慢,第21天后下降明显（p＜0.05）,关节炎临床积分明显下降（p＜0.05）,其中清热活血方高剂量效果最为显著。2大鼠关节骨破坏评估:与模型组相比,清热活血方不同剂量组及MTX组能够增大关节间隙、减轻关节面塌陷程度（H＆E染色、Micro-CT）;减少破骨细胞数量（p＜0.05）;改善骨微结构,提高 BV、Tb.N、Tb.Th、BV/TV,降低 BS、BS/BV、SMI、Tb.Sp（P＜0.01）,其中清热活血方高剂量干预效果显著。肝肾病理结果显示清热活血方安全。3 LncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴、炎症因子及骨代谢标志物表达情况:ELISA检测结果显示,与模型组相比,清热活血方不同剂量组及MTX组能够降低血清炎症因子IL-6、TNF-α的水平（P＜0.01）;RT-qPCR检测结果显示,与模型组相比,清热活血方不同剂量组及MTX组能够下调LncRNA MEG3 mRNA的表达（P＜0.01）,降低 miR-214 mRNA 的表达（P＜0.01）,增加 ATF4 mRNA 的表达（P＜0.01）;降低骨形成标志物BALP、PINP、RUNX2以及骨吸收标志物TRAP、CTX-1、MMP-9 水平（P＜0.01）,提高 PINP/CTX-1 的比值（P＜0.01）,促进骨形成,减少骨吸收。研究结论二1清热活血方可以有效改善CIA大鼠关节炎症状态,抑制骨破坏。2清热活血方可以通过下调LncRNA MEG3的表达,降低miR-214的表达,增加ATF4的表达,提高PINP/CTX-1的比值,调节骨微环境成破骨细胞的平衡,促进骨形成,减少骨吸收,进而抑制CIA大鼠骨破坏。第三部分:清热活血方通过LncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴调节骨微环境成破骨细胞平衡的机制研究研究目的验证LncRNA MEG3、miR-214、ATF4之间的靶向关系,阐明清热活血方体外干预成破骨细胞共培养体系的作用及发挥疗效的机制。研究方法1采用MC3T3-E1细胞作为研究对象,通过细胞转染LncRNA MEG3敲低/过表达载体,运用CCK-8检测细胞增殖;荧光原位杂交检测LncRNAMEG3在细胞中的定位;RNA pull down 实验和 RIP 实验验证 LncRNAMEG3、miR-214、ATF4之间的靶向关系;RT-qPCR、WB及免疫荧光检测lncRNA MEG3、miR-214、ATF4及成骨标志物的mRNA和蛋白的表达情况;2利用Transwell小室,构建成破骨细胞（MC3T3-E1细胞和小鼠骨髓单核细胞）共培养体系,给予清热活血方冻干粉干预。通过茜素红染色和TRAP染色鉴定成骨细胞和破骨细胞;通过CCK-8筛选清热活血方最佳剂量;通过RT-qPCR、WB及免疫荧光分别检测清热活血方最佳剂量干预共培养体系成骨细胞和破骨细胞lncRNA MEG3、miR-214、ATF4及成骨、破骨标志物的mRNA和蛋白的表达情况。研究结果1荧光原位杂交实验显示,lncRNA MEG3主要在细胞质中表达;RNA pull down实验和RIP实验结果表明,lncRNA MEG3与miR-214可以直接结合,ATF4是miR-214的下游靶基因;RT-qPCR、WB及免疫荧光检测结果显示,敲低lncRNA MEG3后,可以显著降低miR-214 mRNA的表达（P＜0.0001）,增加ATF4 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）,同时能提高骨形成标志物BALP、PINP、RUNX2 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）。2通过茜素红和TRAP染色表明,成骨细胞和破骨细胞诱导成功;CCK-8筛选清热活血方最佳剂量为5μg/mL;RT-qPCR、WB及免疫荧光检测结果显示,敲低lncRNA MEG3及清热活血方最佳剂量干预后,能够降低共培养体系中成骨细胞miR-214 mRNA 的表达（P＜0.001）,增加 ATF4 mRNA 及蛋白的表达（P＜0.05）,同时提高骨形成标志物BALP、PINP、RUNX2 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）;敲低lncRNA MEG3及清热活血方最佳剂量干预后,能够降低共培养体系中破骨细胞 miR-214 mRNA 的表达（P＜0.05）,增加 ATF4 mRNA 及蛋白的表达（P＜0.001）,同时降低骨吸收标志物TRAP、MMP-9、MMP-3、CTX-1 mRNA及蛋白的表达（P＜0.05）。研究结论三1敲低LncRNA MEG3能够降低miR-214的表达,提高ATF4的表达,促进成骨细胞的增殖分化。2清热活血方可以通过LncRNA MEG3/miR-214/ATF4调节成破骨细胞的增殖分化,促进骨形成,减少骨吸收。第四部分:清热活血方防治RA骨破坏调控机制临床验证研究目的验证清热活血方通过LncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴调节骨微环境成破骨细胞平衡抑制RA骨破坏的调控机制。研究方法本部分实验采用实时荧光定量PCR（Real-time）法,检测健康人及清热活血方治疗前后RA患者外周血中LncRNA MEG3、miR-214、ATF4及骨形成、骨吸收标志物mRNA的表达情况。研究结果1与健康对照组相比,湿热瘀阻证RA患者LncRNA MEG3、miR-214 mRNA表达水平显著升高（p＜0.001）,ATF4 mRNA表达水平显著降低（p＜0.001）。2与健康对照组相比,湿热瘀阻证RA患者骨形成标志物BALP、PINP、RUNX2以及骨吸收标志物TRAP、CTX-1、MMP-9水平均升高（P＜0.01）,但PINP/CTX-1的比值降低（P＜0.01）。3与清热活血方治疗前组相比,治疗后LncRNA MEG3、miR-214mRNA表达水平显著降低（p＜0.001）,ATF4 mRNA表达水平显著升高（p＜0.001）。4与清热活血方治疗前组相比,治疗后骨形成标志物BALP、PINP、RUNX2以及骨吸收标志物TRAP、CTX-1、MMP-9水平均降低（P＜0.01）,但PINP/CTX-1的比值显著升高（P＜0.01）。研究结论四1 lncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴异常可能介导了骨微环境中成破骨细胞平衡,继而导致RA骨破坏的发生和发展。2清热活血方可以下调lncRNAMEG3,降低miR-214的表达,增加ATF4的表达,调节骨微环境成破骨细胞平衡,促进骨形成,减少骨吸收,进而抑制RA骨破坏。研究结论清热活血方通过LncRNA MEG3/miR-214/ATF4轴调节骨微环境中成破骨细胞平衡,促进骨形成,减少骨吸收,从而抑制RA骨破坏。