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猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）分别引起猪伪狂犬病和猪圆环病,对我国猪养殖业造成了重大经济损失且严重阻碍了猪养殖业发展,被国家农业农村部归为二类动物疫病。近年来猪伪狂犬病病毒出现了新的变异毒株,其传染性及病毒毒力均强于经典毒株,导致Bartha-k61免疫猪群仍出现PRV大流行的态势;PCV2攻击猪的免疫系统,引发免疫抑制,常常呈现出与PRV、PRRSV、PEDV及某些细菌性病原体混合或继发感染,使防控难度更大。本研究以变异株PRV为基础材料,构建携带PCV2-ORF2基因的减毒PRV活载体病毒,并研究其免疫原性,研究结果如下:1.重组病毒PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+的构建基于CRISPR/Cas9基因编辑技术及同源重组原理,设计针对PRV-FJ01TK、g I、g E基因的Sg RNA并构建出带有e GFP及Cap表达盒的转移载体p UC19-TK/e GFP、p UC19-TK/Cap、p UC19-g I/g E/e GFP、p UC19-g I/g E/Cap,旨在对PRV-FJ01进行三基因敲除的同时,将两个Cap表达盒分别嵌合在TK基因和g I～g E位点。首先将PRV-FJ01与p UC19-TK/e GFP、p X459-TK-Sg RNA1及p X459-TK-Sg RNA2共转染PK-15细胞,挑取单个绿色荧光的噬斑,经噬斑纯化得到重组病毒PRV-FJ01 TK-/e GFP+。其次将重组病毒PRV-FJ01 TK-/e GFP+与质粒p UC19-TK/Cap共转染PK-15细胞,挑取无荧光的单个噬斑,分离得到重组病毒PRV-FJ01 TK-/Cap+。同理,对PRV-FJ01TK-/Cap+进行g I和g E基因的敲除及e GFP基因的替换,构建重组病毒PRV-FJ01TK-/g I-/g E-/e GFP+/Cap+。利用同源重组替换e GFP基因,挑取单个噬斑进行数轮纯化并基因测序,最终成功构建出嵌合两个Cap表达盒的重组病毒PRV-FJ01TK-/g I-/g E-/2Cap+。PCR鉴定重组病毒TK、g I、g E基因均为阴性,测序结果表明TK、g I、g E基因被PCV2-ORF2基因成功替换。对小鼠接种重组病毒后进行PRV g B、g E抗体ELISA检测结果为g E抗体阴性、g B抗体阳性,表明重组病毒能诱导小鼠产生免疫应答反应并且野毒标志基因g E无表达。通过Western blotting对重组病毒PRV-FJ01 TK-/Cap+及PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+分别进行PCV2-Cap蛋白的检测,其结果表明仅PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+表达Cap蛋白,说明g I、g E处嵌合的Cap表达盒成功表达,而TK位点处的Cap表达盒未表达。2.重组病毒PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+免疫原性研究对亲本毒株PRV-FJ01和重组病毒PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+进行TCID50测定,其TCID50分别为107.643TCID50/m L和106.417TCID50/m L。分别测定重组病毒PRV-FJ01TK-/g I-/g E-/2Cap+及亲本株PRV-FJ01不同时间段的TCID50并绘制病毒一步生长曲线,结果表明重组病毒PRV-FJ01 TK-/g I-/g E-/2Cap+生长动力学低于亲本株PRV-FJ01。小鼠安全性实验表明重组病毒不引起小鼠出现发热、精神沉郁及瘙痒等临床症状,对小鼠具有安全性。重组病毒免疫家兔后,在第7d、14d、21d分别采血测定血清对亲本株PRV-FJ01的中和效价,测出其中和抗体效价分别可达2~8、211和210。同时ELISA实验表明第7d、14d、21d均测得Cap抗体为阳性。小鼠保护性试验表明,当使用10~5TCID50的亲本株PRV-FJ01侵袭小鼠时,10~5TCID50的Bartha-k61疫苗株无法为小鼠提供完全保护,接毒后仍有20%的小鼠死亡,而10~4TCID50的PRV-FJ01TK-/g I-/g E-/2Cap+可为小鼠提供完全保护,小鼠全部存活且不表现临床症状。