布鲁氏菌病(brucellosis)是一种波及世界的重要的人畜共患病,对畜牧业造成了严重的经济损失,因为它人畜共患病的特点,也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而,迄今为止,都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌(Brucella),又称作布氏杆菌,是造成布鲁氏菌病的病原体,要研发出安全有效的疫苗,对该菌各类基因的功能研究是十分重要的。目前,对布鲁氏菌基因的功能研究存在许多困难。一是布鲁氏菌生长缓慢,在实验室稳定的培养环境下,菌体需要生长36-48h才能在平板上长出肉眼可见的菌落。初次分离的野生菌株生长往往更加缓慢。二是布鲁氏菌病人畜共患的特征,使得对布鲁氏菌的操作变的相当繁琐和耗时。这些因素都使得对布鲁氏菌基因的研究变得格外困难。目前,对布鲁氏菌基因功能的研究主要是依靠自杀质粒,通过单交换和双交换建立基因缺失株,再通过对基因缺失株的研究探索基因功能。但是,该方法耗时长,操作量大,大大增加了科研人员的操作风险,同时也减缓了研究进度。所以,在布鲁氏菌中创建一类迅速、精准、有效的基因研究方式是具备重要意义的。CRISPRi与CRISPR/Cas9系统,是近年发展迅速的领先的基因研究方法。由于其快速、精确、高效的基因编辑效果,马上成为众多科学家的研究热点。当前已普遍用在对多种生物的研究中。为此,本研究中,我们研究了CRISPRi与CRISPR/Cas9系统在布鲁氏菌中应用的可行性。首先,我们建立了可在布鲁氏菌中复制表达的CRISPRi工作质粒。CRISPRi系统由两个重要部分组成,具有阻遏目标基因转录功能的dCas9蛋白和具有目标基因识别功能的sgRNA。本研究中,我们以布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19为靶基因设计sgRNA,对omp19的表达进行下调,评估了CRISPRi系统在布鲁氏菌中对基因表达下调的作用。此外,我们又建立了可在布鲁氏菌中复制表达的CRISPR/Cas9工作质粒,并利用该表达系统尝试对布鲁氏菌omp19基因进行敲除。主要成果如下:1.利用CRISPRi系统使布鲁氏菌外膜蛋白基因omp19表达下调,且下调具有显著性。成功构建2种可以在布鲁氏菌中复制的CRISPRi工作质粒,分别通过组成型表达和诱导型表达的形式表达dCas9蛋白。设计sgRNA,靶定下调omp19基因。将CRISPRi工作质粒转化布鲁氏菌16M感受态,应用实时荧光定量PCR分析该基因在mRNA水平的表达,通过western blot的方法分析该基因在蛋白水平的表达。结果显示,omp19基因表达量下调,并具有显著性。2.利用CRISPR/Cas9系统成功切割布鲁氏菌基因组。成功建立了在布鲁氏菌中诱导型表达wtCas9蛋白的CRISPR/Cas9工作质粒。设计sgRNA,在omp19基因上对布鲁氏菌基因组进行切割。将该质粒转化至布鲁氏菌16M感受态,结果显示CRISPR/Cas9成功地切断布鲁氏菌基因组。3.增强了布鲁氏菌通过非同源末端连接途径(non-homologous end joining,NHEJ)的基因修复功能。构建能够在布鲁氏菌中复制并表达NHEJ途径重要相关蛋白Mku与LigD的工作质粒,且验证了该质粒增强了菌体内NHEJ途径的修复活性。