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在动物生产中,往往伴随着多种肠道疾病,给畜牧业带来了巨大的经济损失。肠道作为机体最大的细菌内毒素库,拥有完整的肠道上皮屏障,对维持上皮细胞通透性、机体内环境的稳态有重要作用。肠上皮细胞作为对抗肠道细菌、毒素的第一道防线,时刻接触细菌或LPS,而致病菌的侵入或者LPS可介导肠上皮细胞损伤,进而引发多种疾病的发生。益生元和益生菌通过提高机体免疫力、改善动物胃肠道的微生态环境、抑制病原菌的粘附、改善肠道组织形态,成为养殖行业中能取代抗生素的最有前景的产品之一。但益生菌的研究和应用中还存在很多瓶颈问题,尤其是如何使益生菌添加后迅速地定植、生长以及在机体内保持丰富的浓度。这些问题的解决才能使其稳定地发挥作用。魔芋甘露低聚糖是一类从魔芋中提取的功能性低聚糖,具有调节免疫防御和益生元特性,促进益生菌的生长繁殖,增强益生菌的作用。鉴于益生菌单独使用中存在的问题以及魔芋甘露低聚糖良好的益生特性及发展前景,本研究利用LPS诱导构建肠上皮细胞损伤模型,筛选能够利用魔芋甘露低聚糖的益生菌,分别探讨外源添加魔芋甘露低聚糖、益生菌及其与寡糖协同对肠上皮细胞损伤模型的修复作用。主要研究结果如下:1.益生菌的培养与鉴定对4株试验菌株培养纯化后分别进行生理生化鉴定和革兰氏、芽孢染色,结果发现:试验菌株均为革兰氏阳性菌,3株含有芽孢,1株不含,其生理生化特征分别与地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌相一致。提取各菌株的基因组DNA,进行16sr RNA扩增、测序,结果发现:所测的菌株序列分别与上述菌株同源性最高。基于以上结果可知,培养的4株菌分别为地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。2.筛选利用魔芋甘露低聚糖的益生菌菌株将3种不同浓度(1 g/L、1.5 g/L和2g/L)的魔芋甘露低聚糖与各菌株混合培养,利用紫外分光光度计检测魔芋甘露低聚糖对益生菌生长的影响,筛选出能有效利用寡糖的益生菌菌株。研究结果发现:与对照组相比,魔芋甘露低聚糖对枯草芽孢杆菌有显著的促生长作用,且魔芋甘露低聚糖的最佳作用浓度为2 g/L,两者最佳反应时间是24 h。3.肠上皮细胞损伤模型的构建利用不同浓度的LPS刺激Caco-2细胞,q PCR检测炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,结果发现:与对照组相比,TNF-α和IL-1β基因的表达显著上调,且当LPS浓度达1μg/m L,作用时间6 h时,上调最为显著。进而利用MTT法检测Caco-2细胞活性,结果发现:与对照组相比,1μg/m L LPS处理组的Caco-2细胞活性显著降低。利用实时细胞分析仪检测Caco-2细胞阻抗的变化,LPS处理组阻抗值显著下调,这表明LPS能增加Caco-2细胞的通透性。用W estern blot检测ZO-1在蛋白水平的表达,结果显示,ZO-1表达显著下调,表明L PS刺激能引起上皮紧密连接的损伤。综合以上结果,表明1μg/m L LPS刺激Caco-2细胞,作用时间6 h,能成功构建肠上皮细胞的损伤的细胞模型。4.魔芋甘露低聚糖和益生菌对肠上皮细胞损伤的修复及协同作用外源添加不同浓度的魔芋甘露寡糖、益生菌及其复合物于肠上皮损伤细胞中,MTT法检测细胞活性,q PCR检测IL-6,TNF-α,IL-1β,MUC-2,Claudin-1,ZO-1 m RNA表达,W estern blot检测ZO-1蛋白表达。结果发现,与LPS损伤组相比,寡糖添加组、益生菌添加组、寡糖与菌联合添加组的Caco-2细胞活性显著上调,TNF-α,IL-6,IL-1βm RNA表达显著下调,ZO-1,Claudin-1,MUC-2 m RNA表达显著上调,ZO-1蛋白表达上调。与益生菌添加组相比,寡糖益生菌联合添加组的Claudin-1,ZO-1,M UC-2 m RNA表达显著上调;与寡糖添加组相比,寡糖益生菌联合添加组Caco-2细胞活性显著上调。表明益生菌、寡糖及两者共同作用均能对LPS引起的Caco-2细胞损伤进行修复,且寡糖与益生菌共同作用比益生菌和寡糖单独使用的修复作用在某些指标上更加显著。