酶是所有生命活动的基础。生命体中的每个细胞都是一个独特的生化系统,其中会发生成千上万的生化反应。我们每一次吃饭、喝水、呼吸或者睡觉时发生的生化反应都有酶的参与。这些酶是自然界中最好的催化剂,几乎没有人造的催化剂能够超越它们。与一般催化剂相比,酶催化反应通常在生理温度和压力下进行,而且具有极高的催化效率。酶是化学家们最好的老师,通过对酶的结构和功能的探讨,可以深入研究酶的催化特性,从而扩展酶在化学工业和日常生产生活中的应用。研究酶催化反应的难点之一是化学反应通常非常快速以致于仅仅通过实验手段很难获得反应机理的详细信息。近年来,随着计算机硬件和软件的飞速发展以及理论化学方法的日趋完善,计算化学在大尺度生化体系研究中的应用越来越广泛,现在已经成为研究酶催化反应机理的重要工具。本论文主要使用量子力学与分子力学组合(QM/MM)的方法系统地探讨几类重要的含铁酶和糖相关酶的催化反应机理。通过理论研究深入探讨了酶与底物的作用机制和酶催化反应的详细历程,确定了催化反应的最优路径、反应过程中涉及到的过渡态和中间体的结构以及相关的能量学信息,明确了酶活性中心一些关键残基的重要作用。研究结果不仅能够与现有的一些实验结果很好地吻合,还对实验结果做了进一步的补充。这些理论研究对实验上探讨相关酶的催化机理及实际应用都有一定的指导意义。本论文的主要研究工作如下：(1)碳青霉烯合成酶(CarC)催化机理的理论研究碳青霉烯是p-内酰胺类抗生素的一个重要分支,与其它p-内酰胺类抗生素相比,碳青霉烯类的抗菌谱更广,抗菌活性更强,且对p-内酰胺酶表现出更高的稳定性。然而,近年来越来越多的研究表明细菌对碳青霉烯的抗药性正在增加。因此,深入研究碳青霉烯的生物合成机制对制药工程上设计新的碳青霉烯变体以抵抗细菌的抗药性显得尤为重要。简单的天然碳青霉烯-3-羧酸的生物合成只需要三种酶,其中一种是碳青霉烯合成酶(CarC)。CarC属于FeⅡ和2-羰基酮戊二酸依赖的氧化酶家族,在碳青霉烯生物合成路径中,CarC催化(3S,5S)-碳青霉烷发生C5-差向异构化和C2/3-去饱和化反应转化成(5R)-碳青霉烯。基于早期Clifton等人报道的晶体结构,实验和理论计算都对差向异构化和去饱和化机理进行了研究。但是考虑到这个晶体结构是不完整的,其中缺失了活性位点附近的两部分关键loop区,先前建议的反应机理的合理性值得怀疑。最近,实验上报道了CarC的完整晶体结构,使得我们可以通过QM/MM计算探讨其详细的催化机理。我们首先分析了O2在金属上的结合位点,并识别出FeⅣ=O有两种潜在的朝向：其氧基正对着His101或者正对着His251。前者能量上很不稳定且不能与底物反应,但是它可以通过氧基的旋转快速异构化成后者。残基Arg67在调控双氧结合和协助FeⅣ=O异构化方面起着重要作用。与早期理论计算建议的耦合的差向异构化和去饱和化反应不同,QM/MM计算结果明确支持分步的差向异构化和去饱和化反应,整个催化反应需要两个完整的氧化循环。在差向异构化反应中,CarC催化(3S5S)-碳青霉烷转化成初始产物(3S,5R)-碳青霉烷,反应涉及到H5原子夺取、C5-自由基的翻转和反向C5-H键的重建。在去饱和化反应中,(3S,5R)-碳青霉烷以一个新的朝向重新结合进CarC的活性位点。C2-C3去饱和化反应中除了FeⅣ=O没有涉及到任何活性位点残基。计算结果表明与(3S,5S)-碳青霉烷相比,(3S,5R)-碳青霉烷中间体更适合作为CarC的底物。在CarC的作用下,(3S,5R)-碳青霉烷中间体可以通过高效的去饱和化反应直接转化成最终产物(5R)-碳青霉烯。此外,在CarC催化反应中,底物羟基化一直与目标异构化和去饱和化反应竞争。我们的研究提供了详细合理的CarC催化机理,这对碳青霉烯抗生素的生物合成工程有一定的指导意义。(2)工程细胞色素P450BM3酶催化机理的理论研究典型的P450酶通常催化O2参与的C/N-H键活化、烯烃环氧化、醛/酮烯化反应等。与酶催化的烯烃环氧化反应类似,有机合成上经常通过把等电子的卡宾转移给烯烃来得到新的环丙烷产物,但是这种反应在生物体内几乎不可能发生。受P450酶催化的化学、区域和立体选择性的启发,Arnold课题组于2013年首次报道了P450BM3酶的工程变体催化烯烃的环丙烷化反应。近年来的研究发现工程P450酶还能催化C-H胺化反应、硫亚胺化反应、氮杂环丙烷化反应等。这些研究不仅丰富了P450酶的应用价值,也对实验上设计其他的一些新酶催化合成更多的自然界不常见的反应提供了一个坚实的基础。遗憾的是,到目前为止工程酶催化反应机理的理论研究依然鲜有报道。以工程P450BM3酶催化的烯烃环丙烷化反应为例,尽管实验上通过设计一些P450变体并使用不同的叠氮酯试剂和烯烃,已经充分证明了这种反应的可行性和可调性,但是并没有从微观水平上对环丙烷化反应机理以及反应的立体选择性进行更深层次的探索。在本章中,我们应用QM和QM/MM方法详细研究了工程P450BM3酶催化的苯乙烯环丙烷化机理以及反应的立体选择性。QM计算结果表明不管Fe-卟啉卡宾的轴向配体是巯基还是羟基,其基态都是三重自旋态,这也与QM/MM计算结果一致。Fe-卟啉卡宾是一个高活性的中间体,在三重态势能面上Fe-卟啉卡宾很容易与苯乙烯的末端烯基反应生成一个C-自由基中间体,随后C-自由基进攻Fe-C键上的C原子得到最终的环丙烷化产物。反应的立体选择性只取决于叠氮酯试剂和苯乙烯在工程P450BM3酶活性中心的相对朝向,而不能仅仅从某一种固定的相对朝向出发通过在反应中旋转苯基或者酯基来实现。QM/MM计算进一步发现,把工程P450BM3-CIS酶中Fe的轴向半胱氨酸配体突变成丝氨酸在一定程度上有利于cis产物的形成,这与实验结果基本一致。这些理论研究揭示了工程P450BM3酶催化的立体选择性的本质,对实验上设计新的P450酶变体以提高反应的立体选择性具有重要的指导意义。(3)尿苷二磷酸连接糖氮-乙酰基转移酶(WIbB)催化机理的理论研究氮-乙酰基转移酶(NAT)是最大的超酶家族之一,它能催化乙酰基辅酶A(acetyl-CoA)转移其乙酰基到各式各样的受体底物的氨基上。研究证实NAT参与很多的生理活动,例如：人体中致癌物的活化和解毒、细菌中氨基甙抗生素的灭活、组蛋白修饰以及脊椎动物的睡眠-觉醒周期等。ManNAc3NAcA是一种不常见的双氮-乙酰基化的脱氧糖,广泛存在于一些革兰氏阴性病菌的外膜中,其前驱体是UDP-ManNAc3NAcA,通常由五种酶联合催化合成得到。第四种酶在Bordetella pertussis中也称作WlbB,是一种氮-乙酰基转移酶,它催化尿苷二磷酸-2-乙酰氨基-3-氨基-2,3-二脱氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NA)转变成尿苷二磷酸-2,3-二乙酰氨基-2,3-二脱氧-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcNAc3NAcA)。本文使用QM/MM方法探讨了WIbB催化的乙酰基化机理。乙酰基化反应是在底物的协助下完成的,没有任何活性位点残基直接参与。与实验上建议的氧负离子四面体中间体不同,通过计算发现反应会经历一个带负电荷的CoA和一个带正电荷的中间体。尽管残基Asn84没有直接参与酶催化反应,但是其在合理定位底物氨基上的孤电子对朝向及稳定过渡态和中间体方面起着重要作用。此外,理论研究还发现一个合理的初始酶-底物复合物结构对准确探讨酶催化机理并获得合理的能量关系至关重要。(4)脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱水酶(DesIV)催化机理的理论研究脱氧糖是一类重要的碳水化合物,广泛存在于细菌细胞表面的糖蛋白、脂多糖和糖脂中,也存在于很多微生物二级代谢产物中。D-脱氧糖胺就是一种典型的脱氧糖,它不仅参与很多的生命活动,还是一些大环内酯类抗生素如酒霉素、嘌呤霉素和红霉素等的重要组成部分。临床研究表明在大环内酯类抗生素中如果存在脱氧糖,它们的生物活性会明显增强。相反,如果从这些药物中移除脱氧糖,它们的药理特性会被减弱甚至被消除。脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖-4,6-脱水酶(DesIV)是D-脱氧糖胺生物合成路径中必需的一种酶,它催化脱氧胸苷二磷酸-葡萄糖(dTDP-glucose)转化成脱氧胸苷二磷酸-4-酮-6-脱氧葡萄糖(dTDP-4-keto-6-deoxy-glucose)。尽管实验上对DesIV的结构和机理进行了大量研究,但是依然有几个机理上的重要争议没有得到解决。本文使用QM/MM方法深入研究了DesIV的催化机理。计算结果表明整个DesIV催化过程可以划分为三个连续的化学步骤：氧化、脱水和还原,包含四个酶催化的基元反应和一个非酶催化的烯醇-酮式互变异构反应。氧化步骤以一个协同异步的机理(质子转移先于氢负离子转移)进行,能垒是21.1 kcal/mol。脱水反应需要残基Glu129和Asp128参与,反应以一个分步的机理进行,经历一个烯醇负离子中间体。在最后的还原步骤中,NADH把一个氢负离子转移给糖基C6原子,同时Tyrl51自发地转移一个质子给C4-酮基,得到一个稳定的烯醇作为酶催化反应的产物。一旦这个烯醇糖从酶活性中心释放出来并进入到溶剂中,在水分子协助下它很容易发生烯醇-酮式互变异构转变成更稳定的酮糖产物。这些计算结果为DesIV的机理研究提供了新的视角和启示,也对其它同家族葡萄糖脱水酶的机理研究提供了一个可靠的理论基础。(5)尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脱水酶(TunA)催化机理的理论研究尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺-5,6-脱水酶(TunA)是短链脱氢酶/还原酶(SDR)家族的一个特殊成员,它催化尿苷二磷酸-氮-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)转化成尿苷二磷酸-4-酮基-氮-乙酰葡糖胺-5,6-烯(UDP-4-keto-GlcN Ac-5,6-ene)。TunA是衣霉素生物合成路径中必需的一种酶。衣霉素是一种重要的酰基核苷类抗生素,它能够抑制具有包膜的病毒的繁殖,是医学上常用的抗生素之一。本文通过QM/MM计算详细探讨了TunA的催化机理。与DesIV类似,TunA催化反应也可划分成氧化、脱水和还原三个连续的化学步骤。氧化步是一个吸热反应,能垒是21.6 kcal/mol,并且它以一个协同异步的机理进行。脱水反应以E1cB机理进行,包含质子转移和羟基消除两步。残基Glu121先作为一个广义碱然后再作为酸参与水的消除反应,而Cys120虽然没有直接参与反应,但是它在维持活性位点排布方面起着重要作用。还原步是氧化反应的逆反应,也是以协同异步机理进行,只不过氢负离子转移先于质子转移发生。通过理论计算我们修订了先前实验上建议的TunA的催化机理,这能为其它SDR家族成员的催化机理研究提供一定的理论指导。(6)果胶酸裂解酶(BsPel)催化机理的理论研究胶质不仅是植物细胞壁的重要组成部分,参与很多的生化过程,还是食品工业上广泛使用的增稠剂和稳定剂。在植物软腐烂过程中,果胶酸裂解酶是解聚胶质必不可少的一种酶,其催化聚半乳糖的α-1,4糖苷键裂解,产生4,5-不饱和的寡半乳糖。虽然实验上已经对很多植物致病菌中的果胶酸裂解酶的结构和功能进行了大量的研究并取得了很多重要进展,但到目前为止还没有对其催化应机理进行系统的理论研究。本章我们使用QM/MM方法详细研究了Bacillus subtilis菌属果胶酸裂解酶(BsPel)催化的反式β-消除机理。残基Arg79作为催化碱夺取底物α-质子,得到一个能量上很不稳定的碳负离子中间体,其上的糖苷键很容易断裂形成一个4,5-不饱和的半乳糖产物和一个带负电的β-离去基团。酶活性中心的Ca2+离子不仅能够通过配位键使底物准确结合进酶的活性中心,还能有效地降低底物α-质子的pKa值以促进质子转移的发生。β-离去基团的质子化反应中需要的质子并不是来自于Arg84或者其它酶活性中心残基,而是很有可能来自于溶剂水分子。此外,理论研究还发现QM区和Active区的选择对准确探讨酶催化反应至关重要。本论文的特色和创新之处：(1)使用QM/MM方法深入探讨了碳青霉烯合成酶的催化机理,确定了02分子在辅因子Fe上的结合位点以及FeⅣ=O的潜在朝向,明确了分步的差向异构化和去饱和化机理及反应的详细细节,同时阐明了活性位点残基的关键作用,对实验上研究碳青霉烯的生物合成路径以及制药工程上设计新的碳青霉烯变体以抵抗细菌的抗药性具有重要的指导意义。(2)使用QM和QM/MM方法深入研究了工程P450BM3酶催化的烯烃环丙烷化机理,确定了反应的具体细节,明确了酶蛋白环境对环丙烷化立体选择性的重要作用,进一步探讨了不同Fe-卟啉轴向配体对立体选择性的影响。这些研究为实验上设计新的P450酶变体以提高反应的立体选择性奠定了必要的理论基础。(3)使用QM/MM方法系统研究了两类葡萄糖脱水酶的催化机理,通过理论计算解决了机理研究上存在的几个争议,修订了早期实验上建议的氧化-脱水-还原三步反应机理,确定了反应的最优路径及相关残基的作用,这些结果对其它同家族葡萄糖脱水酶的机理研究具有一定的指导意义。