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研究背景感染性角膜炎是世界性的常见致盲眼病,具有发病率高,视力损害严重的特点。角膜感染的主要病原有细菌、真菌和病毒等。国内外研究表明细菌性角膜炎主要病原菌主要是革兰阳性球菌,以葡萄球菌最为常见,其次为革兰阴性杆菌,以绿脓杆菌最为常见。感染性角膜炎的病理过程包括病原体的致病因子对角膜的毒性作用以及宿主识别病原体的入侵后启动的防御反应。中性粒细胞作为角膜抗感染固有免疫第一道防线,在角膜感染早期病原体的杀灭与炎症控制及对病变发展与预后具有关键作用。特别在细菌性角膜感染中,中性粒细胞迁移至炎症部位,吞噬病原体,发生细胞内呼吸爆发,产生活性氧类物质并脱颗粒释放抗菌肽杀伤病原体,同时产生各种炎症介质趋化更多的细胞浸润扩大炎症反应,促进病原体的杀灭与清除,对于角膜早期感染的控制具有重大意义。最近发现一种称之为中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)的新的中性粒细胞杀菌机制。所谓NETs是中性粒细胞在感染部位主动释放大分子DNA作为网状支架,对病原菌进行包围及限制,通过附着于DNA支架上的组蛋白和颗粒蛋白杀灭病原菌的过程。研究者在许多炎症性疾病观察到NETs的形成,认为其在抗感染免疫中发挥重要作用。如何通过调控NETs的形成来改变这些疾病的病变发展和预后成为人们研究的重点。糖皮质激素具有强大的抗炎作用,对许多慢性炎症、过敏性、自身免疫性疾病的病变治疗与病情缓解具有不可替代的作用。但糖皮质激素可抑制抗感染免疫应答,故在许多感染性疾病的临床治疗中是否使用激素一直存在争议。如何判断糖皮质激素使用的适应症,成为许多临床医生面临的巨大挑战。深入研究糖皮质激素的免疫调控机制,对于临床上合理选择和使用药物、制定更为有效的治疗方案等具有重要的参考价值,以达到既能高效清除病原菌又能减少组织损伤的目的。NETs作为感染免疫中的重要因素,其受糖皮质激素的调控显然也会影响到整个药物使用对疾病的效应。然而,NETs的体内形成机制还未完全阐明,在眼部疾病中的研究更是屈指可数。本文我们主要就糖皮质激素对NETs的形成与杀菌率的干预作用以及NETs形成在感染性角膜炎发生发展中的作用加以研究。研究方法本研究体外实验部分采用分离自健康志愿者外周血的原代中性粒细胞及培养并诱导分化的人早幼粒白血病细胞系HL-60。金黄色葡萄球菌和经典的NETs刺激物PMA用来诱导NETs形成。免疫荧光染色后显微镜下观察NETs的形态。而地塞米松对NETs形成的干预主要通过sytox green染色与荧光显微镜拍照,胞外游离DNA定量检测(picogreen DNA检测试剂盒)及细菌负荷率检测方法来比较。实验中数据统计分析采用GraphPad Prism6.1软件。同时本研究采集了9例感染性角膜炎患者的角膜病灶组织刮片,予免疫荧光染色并荧光显微镜下观察NETs的形成。结合患者的病史(发病时间,既往用药)、病程、预后及检验科直接涂片镜检和刮片培养结果,分析NETs形成与角膜炎发生发展预后的相关性。结果1、通过免疫荧光染色法,我们验证了金黄色葡萄球菌和PMA可以诱导中性粒细胞和分化的HL-60细胞形成NETs.这种新的细胞杀菌机制可以杀灭金黄色葡萄球菌。地塞米松预处理可以抑制金黄色葡萄球菌诱导的中性粒细胞和分化的HL-60细胞的NETs形成并降低其杀菌效率；但对于PMA诱导的NETs形成,我们未观察到地塞米松预处理产生显著效应。2、感染性角膜炎患者病灶组织刮片免疫荧光染色可以检测到NETs的存在。结合患者病史,发现NETs的形成影响病变的发生发展预后,尤其对真菌感染性角膜炎患者标本中NETs形成多者病程较短,可以初步得出NETs形成有助于病变消退的结论。结论1、DXM可以抑制金黄色葡萄球菌诱导的NETs形成与杀菌作用；2、NETs可以作为感染性角膜炎新的检测手段,推测其在角膜炎病变进展及预后中起到一定作用。