论文部分内容阅读
流感病毒(Influenza virus)是流行性感冒病毒的简称,属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),分为甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)四型,可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。禽流感(Avian influenza)就是一种由甲型流感病毒引起的传染病,这种传染病不仅可在鸟类、禽类中快速传播,还可感染人类。H5N1亚型属于高致病性禽流感病毒,在1997年首次被发现可以感染人类,截至目前,已经有近千例H5N1感染患者,且死亡率高达50%以上,给人类健康和社会经济带来了巨大的影响和损失。流感疫苗是当今社会对于流感防控最经济、最有效的手段。但是如今市场上销售的流感疫苗主要是以鸡胚基质为主的流感病毒灭活疫苗,传统鸡胚工艺具有很强的局限性,尤其当流感爆发甚至形成大流行时,鸡胚生产周期长,鸡胚的供给不足会成为限制疫苗大量生产的主要因素。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是含有病毒结构蛋白的空心颗粒,不含病毒基因组,具有更高的安全性,且与全病毒疫苗颗粒结构相似,可以诱发机体较强的免疫作用,并且病毒样颗粒主要通过体外细胞表达,不依赖于鸡胚的生产系统。痘病毒天坛株是上世纪中国用于预防天花的疫苗株,同时也非常适合作为外源蛋白的表达载体。它基因组巨大,非必需基因多,可容纳较长的外源基因片段;宿主范围广泛,可在多种不同细胞系内扩增;安全性高,有长期的人体应用历史。本研究的目的是以痘病毒天坛株为表达载体,在Vero细胞内表达H5N1亚型禽流感VLPs,并通过免疫小鼠对其免疫原性进行分析。首先设计并构建了含H5N1病毒HA、NA基因的重组痘病毒穿梭质粒pSCCK-HA/NA,利用pSCCK-HA/NA转染预先感染了痘病毒天坛株的Vero细胞,经过多轮荧光筛选后成功获得表达H5N1亚型禽流感病毒HA、NA蛋白的重组痘病毒rVTT-HA/NA,Western blot鉴定HA、NA蛋白表达正确。通过蔗糖密度梯度离心纯化获得病毒样颗粒,电镜下可以看到形态大小与H5N1病毒类似的颗粒,经Lowry法测定纯化后的VLPs总蛋白含量为93.49μg/mL,经SRID测定HA蛋白含量为24.58μg/mL。以VLPs剂量1μg/只、5μg/只、10μg/只对小鼠进行免疫,同时以H5N1全病毒灭活疫苗剂量1μg/只免疫组作为阳性对照。体液免疫结果表明:5μg/只、10μg/只剂量组血清抗体中和活性均大于1:40,10μg/只剂量组最高可以达到1:180,且在第八周的中和活性与全病毒灭活疫苗组相当;ELISA检测IgG抗体,三剂量组在加强免疫后均可看到IgG效价的明显升高,且效价维持平稳,至第八周未见明显下降。细胞免疫结果表明病毒样颗粒三个剂量组所诱发的脾脏CD8~+T细胞比例均高于全病毒灭活疫苗组,脾脏分泌细胞因子IFNγ的淋巴细胞比例也比全病毒灭活疫苗组高,证明病毒样颗粒诱发的细胞免疫效果较强。本研究为新型病毒样颗粒流感疫苗的研发提供了一定的基础。