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研究背景局限性前列腺癌的五年生存率为100%,但是进展期的前列腺癌的五年生存率大约为31%。大多数患者采用内分泌治疗24月内,。绝大多数患者晚期前列腺癌又会发生骨转移,且骨转移事件一旦发生将会直接危害患者生活质量和生命。目前,前列腺癌唯一可以治愈的治疗手段为前列腺癌根治术。而不能行前列腺癌根治术的患者,目前多会全雄激素阻断治疗,继而大约70%的患者会出现骨转移现象。因此急需开发一种新的有效的治疗方法,来增加CRPC患者的生存时间、降低骨转移相关并发症对的发生率。前列腺癌的发生、发展和基因突变及多种细胞因子的失衡有关。进展期前列腺癌可以高表达多种和细胞生长、侵袭、迁移及成瘤性等相关的生长因子,TGF-岱是其中的一种。TGF-β在前列腺癌的发展中表现为双重作用,在肿瘤细胞的早期主要起到抑制肿瘤细胞生长的作用,但是在进展期肿瘤中TGF-β的作用转变为促进肿瘤细胞的侵袭性和至瘤性,高表达的TGF-β可以诱导溶骨细胞介导的骨质破坏。经典的TGF-β信号通路为smad信号通路,但是non-smad信号通路在肿瘤骨转移中的研究的也比较多。Non-samd信号通路中的转化生长因子β蛋白激活激酶1(TGF-β activated protein kinase1, TAK1)对乳腺癌的骨转移起着重要作用。因此本研究通过siRNA沉默人前列腺癌DU145细胞系TAK1基因的表达,初步研究敲除TAK1基因对人前列腺癌DU145细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及药物敏感性性的变化及作用机制。在前列腺癌发展、转移、耐药等方面,为深入研究TAK1基因的作用机制奠定基础。研究目的研究TAK1siRNA对目标基因表达的干扰作用,检测沉默TAK1表达对前列腺癌DU145细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及药物敏感性的影响及相关蛋白的表达情况,并初步探讨其作用机制。研究方法1.应用siRNA靶向沉默前列腺癌DU145细胞的TAK1基因的表达,qRT-PCR检测TAK1mRNA的表达情况,计算TAK1siRNA的基因敲除效率。2.应用蛋白免疫印迹方法检测TAK1siRNA转染前后TAK1蛋白表达的变化3.成功沉默TAK1基因表达后,利用绘制的生长曲线检测沉默TAK1基因对前列腺癌细胞增殖能力影响。4.应用Transwell小室和划痕实验来分析TAK1siRNA转染前后前列腺癌细胞DU145侵袭和迁徙能力的变化。5.利用骨髓诱导细胞外基质(BM-ECM)和transwell小室(8.0μm和0.4μm孔径)构建体外骨转移模型,观察BM-ECM对前列腺癌细胞的生长促进作用和趋化作用。6.在TAK1siRNA转染前后,利用流式细胞仪检测人前列腺癌细胞凋亡情况的变化。7.用MTT法检测TAK1siRNA转染前后前列腺癌DU145细胞对三种化疗药物(多西紫杉醇(docetaxel)、奥沙利铂(L-OHP)及5-氟尿嘧啶(5-FU))的药物敏感性的变化。8.在TAK1siRNA转染前后,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测前列腺癌细胞表皮生长因子受体(EGFR)、凋亡抑制基因(Bcl-2)、环氧合酶-2(COX-2、β-连环蛋白(β-catenin)、MMP-2、9(基质金属蛋白酶-2、9)及氨基末端激酶(JNK)等基因在转录和翻译水平的变化。研究结果1.利用脂质体转染TAK1siRNA可以高效的敲除TAK1基因的表达,RT-PCR和western blot分析提示,TAK1siRNA可以显著抑制TAK1基因的转录与翻译,差异有统计学意义(P<0.05)。2.细胞生长曲线提示利用TAK1siRNA敲除TAKl基因后,前列腺癌DU145细胞的增殖能力被减弱,从第四天开始差异有统计学意义(P<0.05)3.利用transwell和划痕实验检测侵袭和迁移能力,TAK1siRNA转染后前列腺癌DU145细胞的侵袭和迁移能力均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞仪检测转染前后前列腺癌细胞凋亡率分别为4.13%士0.11%和13.21%士1.41%,敲除TAKl基因表达可以明显增加前列腺癌细胞的凋亡率,两组之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5.骨髓诱导细胞外基质(BM-ECM)对前列腺癌DU145细胞具有促进生长、侵袭和迁移作用,差异有统计学意义(P<0.05)。6.转染TAK1siRNA后,前列腺癌DU145对多西他赛紫杉醇、L-OHP、5-FU的IC50显著低于阴性对照组,TAK1基因沉默后前列腺癌DU145细胞对化疗药物的敏感性明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)；对照组之间三种药物的IC50之间IC50接近,差异没有统计学意义(P>0.05)。7.转染48h时,siRNA-TAK1组的COX-2、Bcl-2、JNK、β-Catenin, MMP2及MMP9的mRNA和蛋白相对表达量均低于negative control组及control组的表达量,差异有统计学意义(P<0.05),而control组与negative control组之间,前列腺癌细胞中上述基因表达量差异无统计学意义P>0.05)结论：沉默前列腺癌DU145细胞TAK1基因的表达可以降低凋亡相关蛋白Bcl-2、JNK,耐药基因环氧合酶-2蛋白,表皮生长因子受体等的表达,从而促进细胞凋亡,抑制细胞生长,增加对化疗药物的敏感性；同时可以下调MMP2,MMP9表达可以降低前列腺癌DU145细胞的侵袭及迁移能力。TAKl基因可能是前列腺癌细胞信号转导网络中的一个关键性靶点。