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长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是我国流行最广泛和最重要的蜱种之一,主要叮咬牛、羊以及多种脊椎动物,是病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌、原虫、支原体、以及衣原体等多种病原重要的传播媒介,主要影响家畜的生产性能,为畜牧业的发展造成极为严重的危害。在众多蜱的防控方法中,免疫学防制是前景最诱人的方法之一。丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,serpin)是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂,参与血凝、纤维蛋白溶解、补体激活、炎症反应及肿瘤抑制过程。广泛存在于动物、植物、病毒和细菌等各种生物中。蜱中的serpin与血液凝固、细胞因子激活等相关的宿主防御反应有关,用蜱的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂免疫宿主,能明显地削弱蜱传播病原的能力,而长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于血淋巴中,研究证明是一种“隐藏抗原”,是抗蜱疫苗候选抗原分子。同时该基因具有抗纤维蛋白酶活性,可能与血淋巴内的血液凝固调节有关。本研究根据GenBank中长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂(Haemaphysalis longicornis serine proteinase inhibitor -2, HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿[0]成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2 DNA片段。将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化E. coli JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E. coli BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析。优化表达条件并大量表达后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性。结果表明:获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2 (序列号AB162827)序列的同源性为98%;构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了大小约为47KDa的HLS2融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7h后融合蛋白的表达量最高;Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应。将前述扩增获得到长角血蜱HLS2基因,与酵母表达载体pPIC9k连接,构建真核表达载体pPIC9K-HLS2,用SalⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化毕赤酵母GS115,在MD平板上挑取重组克隆,经G418抗性筛选重组菌株,并用甲醇诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting对培养物上清进行分析。结果表明:成功构建了HLS2毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-HLS2;经G418抗性梯度筛选获得了高拷贝菌株;电泳分析表明,培养上清中出现了与预测分子大小一致的49KDa左右的目的蛋白,且具有良好的免疫活性。本研究获得的大量HLS2蛋白,解决了抗蜱疫苗的抗原来源问题,为抗长角血蜱疫苗的深入研究奠定了基础。运用DNAStar分子生物学软件,对HLS2蛋白的二级结构及其抗原表位进行了识别分析和预测,结果表明HLS2编码蛋白有较高的抗原指数、较多的抗原表位,这与HLS2编码蛋白具有良好的抗原性相一致;HLS2编码蛋白的N-糖基化位点分析表明,含有三个潜在的N-糖基化位点;为深入研究HLS2编码蛋白的结构和功能提供理论参考,也为以抗原表位为基础的疫苗设计提供指导和借鉴。