论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性神经退行性疾病,其主要临床表现是记忆和认知功能下降,晚期出现痴呆。AD的病理特征之一是脑内出现大量以淀粉样b蛋白（amyloid-βprotein,Ab）为主要成分的弥散性和神经炎性斑块。AD的发病原因和病理机制还不甚清楚,这使得抗AD药物的开发多年来一直都不够理想。因此,阐明AD发病机制、设计与开发新靶点药物对AD防治具有重要意义。有研究发现,泛素耦联酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C,Ube2c）与AD的发生发展有关,其基因高表达与患者认知功能损伤密切关联,但其作用机制仍不清楚。最新报道表明,Ube2c参与细胞自噬的调控,其过表达可抑制自噬发生,下调Ube2c则可促进细胞自噬。自噬是机体清除受损细胞器和错误折叠蛋白进而维持自身稳态的一种重要方式,也参与包括AD在内的神经退行性疾病的发病机制。在AD患者和AD模型小鼠中发现有自噬缺陷,同时Ube2c出现高表达。然而,AD中Ube2c的高表达是否会引起自噬功能紊乱,并进而促进脑内淀粉样病理改变以及认知功能损伤还缺乏足够的支持性证据。另外,如果Ube2c成为治疗AD的一个新靶点,寻找可供临床使用的Ube2c抑制剂也仍是一个面临的挑战和研究空白。因此,本研究首先应用生物信息分析手段进一步确认了AD患者和APP/PS1转基因小鼠脑内Ube2c基因的高表达,在此基础上通过AAV-shRNA靶向基因敲低AD小鼠在体海马以及离体小胶质细胞的Ube2c,系统观察了Ube2c敲低对细胞自噬、AD样脑病理特征和认知行为的改善效应。同时,结合前期发现的抗抑郁新药阿戈美拉汀（Agomelatine,AGO）可有效抑制Ube2c基因表达,本研究还系统调查和分析了AGO腹腔注射对APP/PS1转基因小鼠脑内Ube2c表达、Ab神经炎性斑块、认知行为及海马突触可塑性的影响。这些实验研究旨在探讨AD发病的新机制,为AD防治提供新的靶点和策略。方法:1.Ube2c的生物信息学分析和实验验证利用AlzData数据库整合分析Ube2c基因在AD患者和正常人不同脑区的差异表达情况,通过免疫印迹和免疫荧光技术对8月龄APP/PS1转基因小鼠脑组织Ube2c的蛋白表达和分布进行验证。2.AAV-shRNA介导Ube2c基因敲低的离体和在体实验利用携带shRNA特异敲低Ube2c基因的腺相关病毒（sh Ube2c）,以BV2细胞和APP/PS1转基因小鼠及其同窝野生型小鼠（wild-type,WT）作为实验对象,进行病毒转染实验。采用细胞培养、免疫印迹、免疫荧光、MSD（meso scale discovery,MSD）方法和动物行为学实验手段观察:（1）Ube2c基因敲低对BV2细胞清除Aβ和诱导细胞自噬相关蛋白的影响;（2）Ube2c基因敲低对APP/PS1转基因小鼠海马脑区Aβ病理特征和学习记忆行为的影响。3.AGO干预的离体和在体实验在AGO干预的离体实验中,BV2细胞作为实验对象。经Aβ和AGO孵育处理后,通过免疫印迹技术观察AGO对BV2细胞Ube2c蛋白、自噬相关蛋白的表达以及Aβ的清除效应。在AGO干预的在体实验中,APP/PS1转基因小鼠及其WT小鼠作为实验对象。根据小鼠基因型和药物处理的需要,每天经腹腔给予AGO（10 mg/kg）或等体积AGO溶剂（Vehicle,Veh）,持续30天。给药结束后,采用m RNA测序手段测定和分析经AGO处理的APP/PS1转基因小鼠海马组织基因的表达变化;利用免疫荧光技术检测小鼠海马脑片Aβ斑块和小胶质细胞的数量及分布情况;借助MSD方法检测小鼠海马组织可溶性Aβ40和Aβ42水平;通过Y迷宫自发交替和Morris水迷宫行为学实验测试小鼠学习记忆行为的变化;利用脑内深部电刺激和记录技术诱导小鼠海马CA1区场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,f EPSP）,记录高频刺激诱导的f EPSP的长时程增强（long term potentiation,LTP）和配对脉冲刺激引起的双脉冲易化（paired-pulse facilitation,PPF）。结果:1.Ube2c基因在AD患者及转基因动物脑内异常高表达利用AlzData数据库分析发现,AD患者脑内海马及皮层组织的Ube2c存在不同程度的高表达。动物实验也支持这一结果,APP/PS1转基因小鼠皮层和海马组织Ube2c蛋白出现高表达。特别是,海马脑片免疫荧光实验显示:Aβ斑块所在区域的Ube2c蛋白表达更加明显,并与Iba 1阳性的小胶质细胞存在共定位。这提示,Ube2c高表达与AD的发生特别是Aβ的沉积有关,并且Ube2c可能主要来源于小胶质细胞。在随后的BV2细胞培养实验中,我们发现,Aβ1-42处理可使小胶质细胞Ube2c蛋白表达明显升高（P＜0.001）。2.Ube2c基因敲低对小胶质细胞自噬功能和APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ病理特征及学习记忆行为的影响BV2细胞Ube2c基因敲低实验结果显示,sh Ube2c组的Ube2c蛋白表达较Ube2c未敲低组明显降低（P＜0.05）,p62蛋白表达有下降趋势,LC3BII/LC3BI明显升高（P＜0.01）。同时,与单独Aβ1-42处理组相比,sh Ube2c和Aβ1-42共同处理的BV2细胞Ube2c蛋白（P＜0.01）、p62蛋白（P＜0.001）及胞内Aβ（P＜0.05）的表达或含量均明显降低,而LC3BII/LC3BI则显著升高（P＜0.05）,提示Ube2c基因敲低可减少BV2细胞的Ube2c蛋白表达,促进小胶质细胞自噬和胞内Aβ清除。小鼠海马Ube2c基因敲低实验的免疫印迹结果显示,敲低组APP/PS1小鼠海马Ube2c蛋白表达较未敲低组明显下降（P＜0.05）;同时,海马切片硫磺素S（Thioflavine S,Thio S）染色结果显示,未敲低Ube2c基因的APP/PS1小鼠（APP/PS1-shRNA ctrl）海马区Aβ斑块较WT对照组（WT-shRNA ctrl）明显增多,而Ube2c基因敲低后的APP/PS1小鼠（APP/PS1-sh Ube2c）Aβ斑块的数量（P＜0.01）和面积（P＜0.05）均明显减少。MSD方法检测结果显示,敲低组APP/PS1小鼠海马Aβ40（P＜0.05）和Aβ42（P＜0.01）较未敲低组明显下降。行为学检测表明,与APP/PS1对照组（APP/PS1-shRNA ctrl）相比,Ube2c基因敲低的APP/PS1小鼠（APP/PS1-sh Ube2c）Y迷宫自发交替正确率有所提高（P=0.096）,水迷宫定位航行逃避潜伏期（第六天）明显缩短（P＜0.05）,空间探索目标象限停留时间百分比（P＜0.05）和穿台次数（P=0.067）均有增加。这表明敲低Ube2c基因对APP/PS1转基因小鼠的工作记忆和长期记忆都有所改善。3.AGO对APP/PS1转基因小鼠海马Ube2c高表达和小胶质细胞自噬活动的影响m RNA测序结果显示,与WT+Veh组相比,APP/PS1+Veh组小鼠海马组织出现1822个差异基因。用AGO处理APP/PS1转基因小鼠后,959个差异基因（52.6%）被逆转。对这些逆转基因进行聚类分析的结果表明,AGO主要对APP/PS1转基因小鼠有关细胞稳态和Ca2+调控基因发挥了积极作用。同时,AGO处理也明显抑制了Ube2c基因在APP/PS1转基因小鼠海马组织中的高表达。BV2细胞免疫印迹实验结果显示,AGO预处理明显降低了Aβ1-42引起的BV2细胞Ube2c蛋白高表达（P＜0.001）。这种抑制效应可以被5-HT2C受体激动剂Lorcaserin所逆转（P＜0.001）,而不受MT1/MT2受体拮抗剂Luzindole的影响（P＞0.05）,提示AGO下调BV2细胞Ube2c蛋白表达是通过抑制5-HT2C受体而不是通过激动MT1/MT2受体发挥作用的。同时,与Aβ1-42单独处理组相比,AGO+Aβ1-42组的巨噬细胞标志物CD68（P＜0.05）和细胞自噬相关蛋白LC3BII/LC3BI（P＜0.05）明显升高,自噬底物蛋白p62（P＜0.01）和Aβ总量（P＜0.05）则明显降低。此外,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）和氯喹（chloroquine,CQ）可以抑制AGO和Ube2c基因敲低诱导的BV2细胞清除效应。这提示,AGO可能通过抑制Ube2c蛋白表达,促进BV2细胞的吞噬功能和自噬活动,从而加速了胞内Aβ的清除。4.AGO对APP/PS1转基因小鼠海马脑区AD样病理特征和学习记忆的影响小鼠海马脑切片Iba 1抗体和Thio S染色共定位检测结果显示,APP/PS1+Veh组小鼠较WT对照组小鼠具有较多典型的神经炎性Aβ斑块;经AGO治疗（APP/PS1+AGO）后,Aβ斑块数量和面积均明显减少（P＜0.05）;同时,MSD方法检测结果显示,经AGO治疗后的APP/PS1+AGO组小鼠海马Aβ40和Aβ42较APP/PS1+Veh组小鼠均明显减少（P＜0.05）。此外,APP/PS1+Veh组小鼠较WT+Veh组小鼠Iba1荧光染色阳性的小胶质细胞面积（P＜0.001）和数量（P＜0.01）明显增加,而AGO治疗（APP/PS1+AGO）后两者均显著减少（P＜0.01）。Y迷宫行为学自发交替实验结果显示:三组小鼠的总进臂次数没有明显差异（P＞0.05）;但APP/PS1+Veh组小鼠进臂的自发交替正确率较正常对照WT+Veh组小鼠明显下降（P＜0.01）,经AGO治疗后的APP/PS1转基因小鼠（APP/PS1+AGO）自发交替正确率则明显提高（P＜0.05）。Morris水迷宫定位航行实验结果显示:APP/PS1+Veh组小鼠第3天（P＜0.01）、第4天（P＜0.001）和第5天（P＜0.001）的逃避潜伏期较WT+Veh组小鼠明显延长,而给予AGO治疗后的APP/PS1+AGO组小鼠逃避潜伏期明显缩短（第4天:P＜0.05;第5天:P＜0.001）。空间探索实验结果显示:与WT+Veh组小鼠相比,APP/PS1+Veh组小鼠在目标象限的停留时间百分比（P＜0.05）明显减少;AGO治疗组（APP/PS1+AGO）小鼠的目标象限停留时间百分比则比非治疗组显著增多（P＜0.05）。进一步,对位Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验结果显示:APP/PS1+Veh组小鼠的逃避潜伏期较WT+Veh组明显延长（第7天:P＜0.05;第8天:P＜0.001;第9天:P＜0.001;第10天:P＜0.001）,APP/PS1+AGO组较APP/PS1+Veh组则明显缩短（第9天:P＜0.05;第10天:P＜0.001）。APP/PS1+Veh组小鼠的目标象限停留时间百分比较WT+Veh组明显减少（P＜0.05）,APP/PS1+AGO组较APP/PS1+Veh组则明显增加（P＜0.05）。5.AGO对APP/PS1转基因小鼠海马突触可塑性的影响高频刺激前,各组小鼠f EPSP幅度均随刺激电流强度的加大而增加,同一刺激电流强度下各组间的f EPSP幅度没有明显差异（P＞0.05）。高频刺激后30分钟和60分钟时,AD模型组（APP/PS1+Veh）小鼠的f EPSP斜率百分比较正常对照组（WT+Veh）明显降低（30 min:P＜0.05;60 min:P＜0.01）;AGO治疗组（APP/PS1+AGO）小鼠的f EPSP斜率百分则较AD模型组明显增加（30 min:P＜0.05;60 min:P＜0.01）。同时,各组小鼠的双脉冲易化（PPF）百分比没有显著变化（P＞0.05）。结论:1.AD患者多个脑区和APP/PS1转基因小鼠海马及皮层Ube2c出现高表达,提示Ube2c可能参与AD的发病机制。2.APP/PS1转基因小鼠海马脑片Ube2c高表达、小胶质细胞增生及Aβ的沉积三者具有较好的共定位,提示Ube2c在小胶质细胞中的高表达可能影响了小胶质细胞对Aβ的清除,继而引发AD病理损害和记忆行为下降。3.BV2细胞的Ube2c基因敲低后,自噬促进蛋白表达增加、Aβ总量下降,表明Ube2c基因高表达可抑制小胶质细胞自噬活动及Aβ清除;APP/PS1转基因小鼠海马Ube2c基因敲低后,Aβ病理特征和学习记忆能力得以改善,证实了Ube2c基因高表达在AD中的致病性。4.AGO腹腔注射可使APP/PS1转基因小鼠海马神经炎性斑块减少、突触可塑性增强、认知行为改善,提示外源性给予AGO可能有益于AD的治疗;同时,AGO经5-HT2C受体显著抑制了Aβ处理的BV2细胞和AD小鼠Ube2c基因的高表达,增强了BV2细胞的自噬活动,提示5-HT2C受体介导了AGO的保护效应,5-HT2C受体、Ube2c和细胞自噬相关分子有可能成为开发AD治疗新药的潜在靶点。