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背景乳腺癌是女性中最常见的诊断癌症,也是癌症死亡的重要因素。我国是乳腺癌发病率增长速度最快的国家之一,每年以3%的速度递增,且发病年龄逐渐趋于年轻化,严重威胁着广大女性的生活质量和生命安全。化疗即化学治疗是利用化疗药物杀死癌细胞达到治疗效果的一种治疗方式,是乳腺癌全身治疗的重要手段,但化疗耐药现象的出现使其临床疗效并不理想。紫杉醇是乳腺癌化疗的一线药物,但肿瘤细胞对紫杉醇的耐药抵抗严重影响着其治疗效果。因此,深入探讨乳腺癌紫杉醇耐药机制对降低化疗耐药提高临床疗效具有重要意义。肿瘤细胞耐药的产生机制十分复杂,涉及到多基因的共同调控。微小RNA（miRNA）是一类内源性非编码短链小RNA,在细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化（EMT）等过程中发挥着重要作用,与乳腺癌发生发展和耐药形成密切相关。miR-7-5p和miR-152-3p是miRNA家族成员,被证实可调控相关靶基因在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等过程中发挥着重要的抑制作用,且在逆转替莫唑胺耐药和顺铂耐药等过程中发挥着积极作用,但两者在乳腺癌紫杉醇耐药中的作用并不完成清楚。既往研究表明,miRNAs介导的乳腺癌细胞化疗耐药与EMT密切相关。为此,分析miR-7-5p和miR-152-3p对乳腺癌细胞EMT进程及紫杉醇耐药性的影响对深入了解紫杉醇耐药形成的分子机制以攻克乳腺癌耐药十分必要。乳腺癌耐药形成过程是一个多元而复杂的过程,除了与基因的调控外,还与信号通路的调控密切相关。Wnt/β-catenin信号通路是目前研究较多的Wnt经典通路,在胚胎发育、细胞生长和转移等过程中发挥着重要作用,其异常激活与包括乳腺癌在内的多种肿瘤的发生发展和耐药形成密切相关。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心因子,游离的β-catenin进入细胞核可与T细胞因子4（TCF4）基因结合形成复合物,进而影响下游靶基因的异常转录,参与肿瘤的发生发展;同时,TCF-4是一种重要的转录因子,不仅在Wnt/β-catenin信号通路的活化过程中发挥着重要作用,还与肿瘤的发生发展密切相关。已有研究指出,miR-7-5p和miR-152-3p在乳腺癌中表达下调,且可通过调控细胞增殖和凋亡发挥抑癌作用,但其在乳腺癌细胞EMT进程和紫杉醇耐药中的作用及调控机制并不完全清楚。本研究分为两部分:第一部分主要观察miR-7-5p和miR-152-3p及两者联合对乳腺癌细胞EMT进程和紫杉醇耐药的影响;第二部分主要探讨miR-7-5p和miR-152-3p是否是通过共同靶向TCF4影响Wnt/β-catenin信号通路活化进而参与乳腺癌细胞的EMT进程和紫杉醇耐药。第一部分miR-7-5p和miR-152-3p联合对乳腺癌细胞EMT进程及紫杉醇耐药性的影响目的探讨miR-7-5p和miR-152-3p联合对乳腺癌细胞上皮间质转化（EMT）及紫杉醇耐药性的影响,为临床上进一步治疗乳腺癌提供新线索。方法采用 RT-PCR 检测 miR-7-5p 和 miR-152-3p 在乳腺癌 MCF-7 细胞和 MCF-7/TAX耐药细胞中的表达情况。将体外培养的MCF-7/TAX细胞分为NC组（转染无意义序列）、miR-7-5p 组（转染 miR-7-5p mimics）、miR-152-3p 组（转染 miR-152-3p mimics）和 miR-7-5p/152-3p 组（共转染 miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics）,将 miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics 转染至 MCF-7/TAX 细胞后,RT-PCR检测MCF-7/TAX细胞中miR-7-5p和miR-152-3p的表达水平以评价转染效果,采用Western blotting法检测细胞中EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达水平,Transwell小室实验检测MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力;以0、20、40、60、80和 100μmol/L 紫杉醇处理转染 miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics 后的 MCF-7/TAX细胞,采用MTT法检测MCF-7/TAX细胞对紫杉醇耐药性的影响。采用SPSS22.0软件对实验结果进行统计学分析,多组间比较使用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK-q,两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。结果1.miR-7-5p和miR-152-3p在MCF-7/TAX细胞中的表达:RT-PCR检测结果显示,miR-7-5p在MCF-7细胞和MCF-7/TAX细胞中的相对表达量分别为1.00±0.06、0.26±0.03;miR-152-3p在MCF-7细胞和MCF-7/TAX细胞中的相对表达量分别为1.00±0.08、0.48±0.03;MCF-7/TAX 细胞中 miR-7-5p 和 miR-152-3p 的表达水平较MCF-7细胞明显降低（P＜0.05）。2.miR-7-5p和miR-152-3p联合对MCF-7/TAX细胞EMT进程的影响:①RT-PCR检测结果显示,转染miR-7-5p mimics的miR-7-5p组细胞中miR-7-5p的表达水平（4.65±0.22）较 NC 组（1.00±0.07）明显升高（P＜0.05）,同时转染 miR-152-3p mimics的miR-152-3p组细胞中miR-152-3p的表达水平（3.08±0.15）也显著高于NC组（PP＜0.05）。②Western blotting检测结果显示,NC 组、miR-7-5p 组、miR-152-3p组和miR-7-5p/1 52-3p组细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白的相对表达量分别为0.29±0.03、0.69±0.04、0.52±0.03 和 0.98±0.06,间质标志物 Vimentin 蛋白的相对表达量分别为 0.68±0.04、0.32±0.03、0.45±0.04 和 0.18±0.02,与 NC 组相比,转染miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics 可使 MCF-7/TAX 细胞中 E-cadherin 蛋白表达水平升高,而Vimentin蛋白表达水平降低（P＜0.05）,且两者联合具有协同促进E-cadherin蛋白和抑制Vimentin表达的作用。③Transwell小室检测结果显示,NC组、miR-7-5p 组、miR-152-3p 组和 miR-7-5p/152-3p 组中侵袭细胞数分别为 136.00±11.00、62.00±5.00、75.00±6.00、43.00±5.00,迁移细胞数分别为 252.00±15.00、164.00±10.00、190.00±8.00、105.00±8.00,与 NC 组相比,转染 miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics可使MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力明显减弱（P＜0.05）,且两者联合作用更显著。3.miR-7-5p和miR-152-3p联合对MCF-7/TAX细胞紫杉醇耐药性的影响:以0、20、40、60、80和100μmol/L紫杉醇处理后,MTT检测各组细胞OD值:NC组细胞分别为 0.48±0.03、0.43±0.02、0.38±0.02、0.35±0.02、0.29±0.02 和 0.23±0.02,miR-7-5p 组分别为 0.46±0.03、0.35±0.02、0.27±0.02、0.22±0.02、0.17±0.01 和 0.13±0.01,miR-152-3p 组分别为 0.49±0.03、0.38±0.02、0.33±0.02、0.28±0.02、0.22±0.02 和0.16±0.02,miR-7-5p/152-3p 组分别为 0.45±0.03、0.27±0.02、0.21±0.02、0.16±0.01、0.11±0.01和0.07±0.01;在不同浓度的紫杉醇浓度作用下,转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX细胞的增殖活力较NC组明显降低（P＜0.05）,且共转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX细胞的增殖活力下降幅度较miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics单独作用效果更为明显（P＜0.05）。结论1.miR-7-5p和miR-152-3p联合抑制乳腺癌MCF-7/TAX细胞EMT进程。2.miR-7-5p和miR-152-3p联合降低乳腺癌MCF-7/TAX细胞对紫杉醇耐药性。第二部分miR-7-5p和miR-152-3p联合调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞EMT进程及紫杉醇耐药性的影响目的探讨miR-7-5p和miR-152-3p协同抑制乳腺癌细胞EMT进程及紫杉醇耐药性的分子机制与靶向调控Wnt/β-catenin信号通路有关。方法采用生物信息学软件Targetscan预测miR-7-5p和miR-152-3p的靶基因,双荧光素酶报告基因实验检测miR-7-5p、miR-152-3p与TCF4的靶向关系;采用Western blotting 法检测 NC 组、miR-7-5p 组、miR-152-3p 组和 miR-7-5p/152-3p 组细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子β-catenin及TCF4蛋白的表达水平;实验分为miR-7-5p 组、miR-7-5p+LiCl 组、miR-152-3p 组、miR-152-3p+LiCl 组、miR-7-5p/152-3p 组和 miR-7-5p/152-3p+LiCl 组,在转染 miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics基础上给予Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl处理后,Western blotting法检测MCF-7/TAX 细胞中β-catenin、TCF4 和 EMT 相关蛋白 E-cadherin、Vimentin 蛋白的表达,Transwell小室实验检测MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力;以0、20、40、60、80和100μmol/L紫杉醇处理后,采用MTT法检测激活Wnt/β-catenin信号通路对MCF-7/TAX细胞紫杉醇耐药性的影响。采用SPSS22.0软件对实验结果进行统计学分析,多组间比较使用单因素方差分析,组间多重比较采用SNK-q,两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。结果1.miR-7-5p和miR-152-3p与TCF4靶向关系的验证:Targetscan软件预测结果显示,TCF4 3’UTR区域存在能够与miR-7-5p及miR-152-3p互补的结合位点;双荧光素酶报告基因实验结果显示,转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后可使TCF4-WT报告基因载体的荧光素酶活性(0.28±0.03、0.32±0.02较对照NC组（1.00±0.07、1.00±0.06）明显降低（P＜0.05）;但两者对TCF4-MUT报告基因载体的荧光素酶活性(（0.98±0.05 vs 1.00±0.06、0.95±0.06 vs 1.00±0.05）无明显影响（P＞0.05）。2.miR-7-5p 和 miR-152-3p 对 MCF-7/TAX 细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路活化的影响:Western blotting 检测结果显示,NC 组、miR-7-5p 组、miR-152-3p 组和 miR-7-5p/152-3p组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别为0.52±0.03、0.28±0.02、0.37±0.02 和 0.19±0.02,TCF4 蛋白的相对表达量分别为 0.48±0.03、0.14±0.02、0.26±0.03 和 0.08±0.02,与 NC 组相比,转染 miR-7-5p mimics 和 miR-152-3p mimics后MCF-7/TAX细胞中β-catenin和TCF4蛋白的表达水平较NC组明显降低（P＜0.05）,且两者共同转染后MCF-7/TAX细胞中β-catenin和TCF4蛋白的表达水平较 miR-7-5p 组或 miR-152-3p 组进一步降低（P＜0.05）。3.激活Wnt/β-catenin信号通路对MCF-7/TAX细胞EMT进程的影响:①Western blotting检测 miR-7-5p 组、miR-7-5p+LiCl 组、miR-152-3p 组、miR-152-3p+LiCl 组、miR-7-5p/152-3p组和miR-7-5p/152-3p+LiCl组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别为 0.26±0.03、0.51±0.04、0.40±0.03、0.78±0.05、0.18±0.02 和 0.45±0.03,TCF4 蛋白的相对表达量分别为 0.20±0.02、0.55±0.03、0.31±0.02、0.67±0.04、0.21±0.03 和0.42±0.03,E-cadherin 蛋白的相对表达量分别为 0.81±0.05、0.36±0.03、0.52±0.03、0.25±0.02、1.23±0.09 和 0.46±0.03,Vimentin 蛋白的相对表达量分别为 0.31±0.03、0.68±0.04、0.48±0.03、1.12±0.08、0.21±0.02 和 0.45±0.03,与 miR-7-5p 组或 miR-152-3p 组或 miR-7-5p/152-3p 组相比,给予 LiCl 处理后 MCF-7/TAX 细胞中β-catenin、TCF4和Vimentin蛋白的表达水平明显升高,而E-cadherin蛋白的表达水平明显降低（P＜0.05）。②Transwell 小室检测 miR-7-5p 组、miR-7-5p+LiCl 组、miR-152-3p 组、miR-152-3p+LiCl 组、miR-7-5p/152-3p 组和 miR-7-5p/152-3p+LiCl 组中侵袭细胞数分别为 68.00±6.00、116.00±8.00、76.00±5.00、138.00±12.00、46.00±3.00 和 93.00±5.00,各组中迁移细胞数分别为 162.00±9.00、218.00±15.00、195.00±11.00、246.00±17.00、102.00±8.00 和 159.00±6.00,与 miR-7-5p 组或 miR-152-3p 组或 miR-7-5p/152-3p 组相比,给予LiCl处理后MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力明显增强（P＜0.05）。4.激活Wnt/β-catenin信号通路对MCF-7/TAX细胞对紫杉醇的耐药性的影响:以0、20、40、60、80和100μmol/L紫杉醇处理后,MTT检测各组细胞OD值分别:miR-7-5p 组分别为 0.45±0.03、0.32±0.02、0.26±0.02、0.21±0.02、0.18±0.01 和 0.15±0.02,miR-7-5p+LiCl 组分别为 0.48±0.03、0.41±0.03、0.34±0.02、0.29±0.03、0.23±0.02和0.21±0.02,miR-152-3p 组分别为 0.43±0.03、0.37±0.02、0.32±0.02、0.27±0.02、0.21±0.02和 0.17±0.01,miR-152-3p+LiCl 组分别为 0.47±0.04、0.52±0.03、0.39±0.03、0.33±0.03、0.28±0.03 和 0.21±0.02,miR-7-5p/152-3p 组分别为 0.46±0.02、0.25±0.02、0.20±0.02、0.18±0.02、0.11±0.01 和 0.07±0.01,miR-7-5p/152-3p+LiCl 组分别为0.44±0.03、0.36±0.02、0.28±0.02、0.24±0.02、0.19±0.02 和 0.15±0.01,不同浓度紫杉醇作用下,miR-7-5p+LiCl组细胞增殖活力较miR-7-5p组明显升高;同时miR-152-3p+LiCl组和miR-7-5p/152-3p+LiCl组细胞的增殖活力较相应对照miR-152-3p组、miR-7-5p/152-3p组也均明显升高（P＜0.05）。结论1.TCF4 是 miR-7-5p 和 miR-152-3p 的共同靶标。2.miR-7-5p和miR-152-3p可共同抑制MCF-7/TAX细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活化。