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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白Vip1Ad1与Vip2Ag1是一组二元毒素,对大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)和暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫具有较好的杀虫活性,但其杀虫机理尚不清楚。为探究其作用机制,本研究首先优化了Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白的纯化方法,制备了高纯度的杀虫蛋白。进一步分析了Vip1Ad1、Vip2Ag1、大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟中肠BBMV间的作用条件及方式;揭示了Vip1Ad1和Vip2Ag1作用于大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟中肠的机制。具体研究结果如下:1.建立了Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白的高效纯化体系。首先,本研究比较了硫酸铵沉淀法、膜过滤法及离子交换层析法纯化Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白的回收率、纯度和活性。对Vip1Ad1蛋白回收率比较结果显示,膜过滤法回收率最高(为82.50%),硫酸铵沉淀法回收效率最低(为62.15%);对Vip2Ag1蛋白回收率比较结果显示膜过滤法回收率最高为(为79.30%),硫酸铵沉淀法回收效率最低(为40.75%)。对Vip1Ad1蛋白纯度比较结果显示:离子交换层析法得到的蛋白纯度最高(为76.84%),膜过滤法得到的蛋白纯度最低(为47.56%);对Vip2Ag1蛋白纯度比较结果显示离子交换层析法得到的蛋白纯度最高为(97.00%),硫酸铵沉淀法得到的蛋白纯度最低为(为67.26%)。对活性比较结果显示:离子交换层析法纯化的Vip1Ad1可以与大黑鳃金龟中肠BBMV结合,硫酸铵沉淀法纯化的Vip1Ad1不与大黑鳃金龟中肠BBMV结合。通过回收率、纯度和活性的比较,我们采用了离子交换层析法对Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白进行纯化。2.分析了Vip1Ad1蛋白的寡聚特性。对活化的Vip1Ad1蛋白进行SDS-PAGE检测发现,活化后的蛋白在溶液中有单体和寡聚体。Vip2Ag1对胰蛋白酶的耐受性较差,容易被胰蛋白酶完全消化。用超速离心法分析了Vip1Ad1寡聚体的沉降系数,结果显示:寡聚体主要为三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体。3.分析了Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白的亲和常数。首先通过Ligand blot和等温滴定实验测得活化后Vip1Ad1和Vip2Ag1蛋白在20 mmol Tris-HCl中可以结合形成复合体。通过ELISA测得其亲和常数为58.90±3.9 nmol/L。进一步用超速离心法分析了Vip2Ag1与消化后的Vip1Ad1结合的沉降系数,结果显示Vip2Ag1蛋白可以与Vip1Ad1寡聚体结合。4.分析了Vip1Ad1、Vip2Ag1与大黑鳃金龟中肠BBMV的作用特征。首先用ELISA法测得Vip1Ad1原毒素与大黑鳃金龟中肠BBMV亲和常数为94.3±14.3 nmol/L。其次活化后的Vip1Ad1与大黑鳃金龟中肠BBMV亲和常数为96.5±27.8 nmol/L,当加入Vip2Ag1蛋白后,其亲和常数没有变化。通过Ligand blot实验和LC-MS/MS分析,鉴定到大黑鳃金龟中肠BBMV与Vip1Ad1结合的蛋白为去肌动蛋白(Leptinotarsa decemlineata actin)、肌球蛋白-9(Pediculus humanus corporis myosin-9)、丝氨酸蛋白酶样蛋白(Actias artemis mRNA for serine protease like protein)、肌球蛋白IA(Agrilus planipennis myosin-IA)、细胞质β肌动蛋白1(Cobitis choii cytoplasmic beta-actin 1)等。5.分析了Vip1Ad1、Vip2Ag1暗黑鳃金龟中肠BBMV的作用特征。用Western blot检测发现:Vip1Ad1与暗黑鳃金龟中肠BBMV孵育过程中被活化成单体和寡聚体,二者都可以与暗黑鳃金龟中肠BBMV结合。随后测得Vip2Ag1蛋白可以与暗黑鳃金龟中肠BBMV结合,但结合量较少。当Vip1Ad1加入后,Vip2Ag1蛋白与暗黑鳃金龟中肠BBMV结合量明显增加。上述研究结果表明:蛴螬取食了Vip1和Vip2蛋白之后,肠道蛋白酶对其进行了活化,活化后的Vip1蛋白形成了寡聚体,寡聚体可以与蛴螬中肠结合,但是单独不能损害上皮细胞,Vip2通过与Vip1寡聚体结合后作用于中肠并引起上皮细胞的损伤,进一步导致了蛴螬死亡。相关研究为进一步揭示Vip1和Vip2蛋白的杀虫机制及应用奠定了基础。