【摘 要】
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类异戊二烯是植物和微生物中结构多样且含量最丰富的天然产物家族,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸（MVA）代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但一些关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。为了解决现有研究存在的局限性,通过合理设计生成能显著提高代谢物水平的文库是一种有效策略。为了对文库进行评估,可以建立依赖于生物传感器的筛选方法。本研究以L-阿拉伯糖
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类异戊二烯是植物和微生物中结构多样且含量最丰富的天然产物家族,是橡胶、食品、医药和化妆品工业的重要原料。在微生物中构建甲羟戊酸（MVA）代谢途径是目前生产异戊二烯及其衍生萜烯的有效途径,但一些关键酶的活性和表达水平会限制异戊二烯的合成。为了解决现有研究存在的局限性,通过合理设计生成能显著提高代谢物水平的文库是一种有效策略。为了对文库进行评估,可以建立依赖于生物传感器的筛选方法。本研究以L-阿拉伯糖操纵子为基础,设计了响应于MVA代谢途径中关键代谢物二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的传感器,通过理性构建关键酶——异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）的突变体库,并将传感器应用于筛选,得到以下主要研究成果:（1）以L-阿拉伯糖操纵子的结构和原理为基础,将操纵蛋白Ara C的氨基末端配体结合结构域（LBD）替换成限速酶异戊二烯合酶（Isp S）,构建DMAPP诱导的基因回路。在大肠杆菌中验证了基因回路的荧光强度响应于DMAPP浓度的变化。通过体外DNA-EMSA实验证明了融合蛋白Isp S-Ara C与调控区DNA的相互作用,在无DMAPP时Isp S-Ara C结合于启动子PBAD的I1和O2位点,从而遏制转录起始。将基因回路的设计思路扩展到MVA途径当中的其他3个关键酶:甲羟戊酸激酶（mvk）、HMG-辅酶A还原酶（mva E）和IDI,构建mvk-Ara C、mva E-Ara C和IDI-Ara C基因回路。分别构建积累底物甲羟戊酸、乙酰辅酶A和异戊烯基焦磷酸（IPP）的菌株,发酵实验结果证明mvk-Ara C和IDI-Ara C基因回路均能响应底物的调控,与对照组相比IDI-Ara C在24 h时荧光强度下降了65%,48 h时的荧光强度降低了74%。（2）通过引入3种来源的已知不同活性的IDI来检验Isp S-Ara C和IDI-Ara C基因回路的灵敏性,48 h时菌株BLAIG-ISP的荧光强度的log2FC=1.81,表明Isp S-Ara C基因回路的灵敏性更佳。通过对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）来源的IDI的结构模拟和分析计算得到单点突变位点并构建文库。将Isp S-Ara C用于筛选,同时通过GC-MS检测点突变体库的异戊二烯生成量以验证筛选结果。得到了以下几株活性提高的突变体:Gln16Phe、Asp121Phe、Met146His、Thr276Trp等,与野生型相比其荧光表达显著提高1.23-1.85倍,异戊二烯产量增加了47.6%～104.2%,最高为820.46 mg·L-1。（3）模拟WT和Gln16Phe、Asp121Phe、Met146His、Thr276Trp的结构并进行分子对接和作用力分析,以及口袋区域的计算,比较了突变体相较于野生型提高了异戊二烯产量的结构基础:突变体的残基替换使得酶的二级结构更为紧密,口袋区域更大,与底物IPP的结合更为稳定。通过对突变体Met146His进行启动子文库的替换,优化菌株将其异戊二烯的产量增加了10%。以该突变株为基础进行核糖体结合位点（RBS）优化,得到最优菌株将异戊二烯的产量提升至862.79 mg·L-1,是出发菌株的3.33倍。结果证明对于IDI进行酶分子改造和表达优化以提高酶活性并调控表达水平,是提高异戊二烯产量的有效策略。
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