泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)参与真核生物的细胞周期、凋亡和信号传导等多个生物过程的调节,肿瘤细胞尤其依赖UPS来清除细胞内由于快速增殖而产生的有害的不成熟和不规则蛋白,以增强细胞的抗凋亡能力。此外已有研究证实,泛素存在于模式生物衣藻和盐藻的鞭毛中,并且在线虫、小鼠和人类的纤毛蛋白质组中都已被鉴定出来,因此我们推断UPS可能参与纤毛/鞭毛的生物学功能。纤毛和鞭毛是进化上非常保守的细胞器,结构基本相同,它们都来源于细胞质膜下的基体,向上突出于细胞表面。几乎人类所有类型的细胞都有纤毛,而鞭毛存在于低等真核生物,其基因组结构简单便于进行研究,其中鞭毛内运输机制最早就是在模式生物衣藻中发现的,随后在高等生物的纤毛中也被证实。纤毛/鞭毛的解聚和细胞周期以及外界信号有关,细胞增殖时纤毛发生解聚,基体转变为中心体参与纺锤体的形成,待细胞完成有丝分裂后,细胞又会长出新的纤毛。肿瘤的发生常常伴随着纤毛的异常,且纤毛内存在多个和肿瘤相关信号通路,但二者之间的分子机制尚不完全清楚。纤毛在解聚过程中会有大量的纤毛蛋白被降解,虽然泛素结合体系在纤毛和鞭毛中已被鉴定出来,但蛋白酶体是否参与纤毛/鞭毛的解聚,以及UPS能否通过影响纤毛/鞭毛的功能来参与肿瘤的发生发展未见报道。然而纤毛长度较短不易被观察,且在体外培养容易丢失。鞭毛长度较长,通过简单的理化条件即可诱导其解聚。所以利用模式生物来进行研究可以帮助我们了解UPS和纤毛解聚之间的分子机制。杜氏盐藻和衣藻都为真核生物绿藻,二者的不同之处在于衣藻细胞外有一层细胞壁,其鞭毛上也有细胞壁的延伸,而盐藻则没有,在结构上和哺乳动物更加接近,故本研究选取盐藻的鞭毛作为模式生物器来研究UPS和鞭毛解聚之间的关系,为进一步研究纤毛在肿瘤发生发展中的分子机制提供依据。蛋白酶体由20S核心颗粒(core particle, CP)和19S调节颗粒(regulatory particle, RP)组成。20S CP是蛋白酶体的降解部位,包含水解活性位点；19S RP作为多聚泛素化蛋白的受体,负责将蛋白底物去泛素化并将蛋白解折叠,并运送至20S CP。目前20SCP的抑制剂硼替佐米已经在临床上用于治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤,但易产生耐药性,且对实体瘤的治疗效果差。研究显示,19S RP中的一些去泛素化酶参与肿瘤的发生发展并可以作为潜在的肿瘤治疗靶点。PSMD7是19S蛋白酶体lid中的一个去泛素化酶亚基,对19S RP结构组织的分析表明,在组成lid亚复合体的9个亚基中,PSMD7位于中央核心部位,同时和其他4个亚基相结合,说明PSMD7是19S蛋白酶体lid结构中的重要组成部分,但它在内的具体功能还不完全清楚。为了了解蛋白酶体在纤毛/鞭毛中的分子机制,并寻找肿瘤治疗的有效靶点,本课题从两个方面对PSMD7在胞内可能发挥的功能进行了研究：1.PSMD7是否参与纤毛/鞭毛的解聚?2.它是否可以影响肿瘤的发生发展?第一部分蛋白酶体亚基PSMD7参与纤毛/鞭毛蛋白kinesin的降解目的了解鞭毛解聚过程中蛋白酶体活性的变化,以及PSMD7与纤毛/鞭毛蛋白之间的相互作用,初步研究PSMD7是否参与纤毛/鞭毛的解聚,为进一步研究UPS影响纤毛/鞭毛功能的分子机制打下基础。方法1泛素-蛋白酶体系统在鞭毛解聚后的激活状态用免疫荧光和Western blotting方法检测所提取鞭毛中的泛素结合体系。用IBMX诱导鞭毛解聚后,观察鞭毛中泛素化蛋白的聚集情况；甘油密度梯度离心纯化细胞蛋白酶体,用荧光多肽底物检测蛋白酶体活性的变化；实时荧光定量PCR检测盐藻PSMD7(DsPSMD7)的表达变化。2PSMD7和纤毛/鞭毛kinesin的结合酵母双杂交技术分别检测盐藻中DsPSMD7和鞭毛kinesin(KCBP)及293T细胞中PSMD7(HsPSMD7)和纤毛kinesin(Kif3a)的相互作用,并进一步用GST pulldown和免疫共沉淀验证二者之间的相互作用。用蛋白酶体抑制剂分别处理盐藻和293T细胞,观察KCBP和Kif3a在胞内的降解情况。结果1泛素-蛋白酶体系统在鞭毛解聚后的激活状态鞭毛发生解聚后,鞭毛内泛素化蛋白的量增多,胞内蛋白酶体的活性增加了将近2倍,说明泛素-蛋白酶体系统体参与了盐藻鞭毛解聚过程。DsPSMD7在鞭毛解聚过程中的mRNA水平表达量增高,在鞭毛解聚后30min表达量达到最高。2PSMD7和纤毛／鞭毛kinesin的结合酵母双杂交显示DsPSMD7和KCBP,HsPSMD7和Kif3a可以相互作用,且GST pulldown和免疫共沉淀进一步验证了二者之间的结合。用蛋白酶体抑制剂分别处理细胞后,KCBP和Kif3a两个kinesin在胞内的聚集增多,说明纤毛／鞭毛kinesin的降解由蛋白酶体参与。结论鞭毛解聚后蛋白酶体活性增强,同时PSMD7的表达量增加。纤毛或鞭毛kinesin都可以和PSMD7相互作用,并被蛋白酶体降解,说明PSMD7参与纤毛／鞭毛的解聚。第二部分蛋白酶体亚基PSMD7在食管鳞癌发生中的作用目的鉴于去泛素化酶对肿瘤细胞的生存能力是必需的,我们探讨了PSMD7对蛋白酶体活性的影响,以及在食管鳞癌发生发展中的作用,为深入研究PSMD7在肿瘤细胞中作用的分子机制,以及UPS能否通过影响纤毛/鞭毛的功能来参与肿瘤的发生发展提供实验依据。方法1蛋白酶体在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中的表达差异分别提取正常食管上皮细胞Het-1A和食管鳞癌细胞EC9706和Eca109的细胞核、细胞质和中心体,Western blotting检测PSMD7在各亚细胞结构中的表达。免疫荧光观察PSMD7在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中的定位。2慢病毒介导的PSMD7基因干扰对食管鳞癌细胞增殖、周期和凋亡影响的体外研究检测感染PSMD7RNAi慢病毒的EC9706细胞内泛素化蛋白的聚集情况和蛋白酶体活性的变化,分别用CCK-8实验和流式细胞仪检测细胞的增殖、周期和凋亡的变化。并用Western blotting检测PSMD7基因干扰后对p53表达的影响。同时将PSMD7RNAi慢病毒联合硼替佐米处理食管鳞癌细胞,观察细胞蛋白酶体功能和凋亡的变化。3慢病毒介导的PSMD7基因干扰对移植瘤生长的影响建立裸鼠移植瘤模型,观察PSMD7基因干扰后对食管鳞癌细胞EC9706的致瘤能力的影响。同时用硼替佐米对荷瘤裸鼠治疗两周,测量肿瘤大小以绘制生长曲线,并计算抑瘤率。病理组织学观察成瘤细胞的形态变化,免疫组化检测细胞泛素化蛋白的表达,TUNEL法分析不同处理组的裸鼠移植瘤组织细胞凋亡的变化。结果1蛋白酶体在正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞中的表达差异PSMD7在两株食管鳞癌细胞EC9706和Eca109中的表达均高于正常食管上皮细胞Het-IA,在三种细胞的细胞核中的表达没有明显变化,但在食管鳞癌细胞质和中心体中的表达明显高于正常食管上皮细胞。2慢病毒介导的PSMD7基因干扰对食管鳞癌细胞增殖、周期和凋亡影响的体外研究PSMD7RNAi可以使EC9706胞内多泛素化蛋白增加,蛋白酶体的活性降低,抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡,还可以影响胞内p53的功能。此外PSMD7基因干扰后还可以增强硼替佐米对蛋白酶体功能的抑制和肿瘤细胞的凋亡。3慢病毒介导的PSMD7基因干扰对移植瘤生长的影响PSMD7基因干扰后的EC9706细胞在裸鼠体内生长缓慢,肿瘤体积只有对照的组的1/2。其联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗对肿瘤抑制率最高,肿瘤体积是对照组的40%,病理组织学检查发现成瘤细胞的异质性降低。免疫组化结果显示PSMD7基因干扰组、硼替佐米治疗组和联合治疗组细胞中的泛素化蛋白均增多,TUNEL显示治疗组的细胞都有不同程度的凋亡,其中联合治疗组凋亡的比例最大。结论PSMD7在食管鳞癌细胞中的高表达,且定位发生改变。PSMD7RNAi可以降低食管鳞癌细胞蛋白酶体的活性,使细胞增殖能力降低,并诱导细胞的凋亡,对肿瘤生长有明显的抑制作用,还可以增强食管鳞癌细胞对硼替佐米的敏感性。抑制PSMD7的表达能降低蛋白酶体的功能来诱导肿瘤细胞的凋亡,提示它可能是食管鳞癌的一个有效治疗靶点。