论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病。它的病原是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PED V)。近几年,该病在中国广泛蔓延,造成了严重的经济损失,引起了中国各研究单位对其病原PEDV的关注。PEDV野外分离的流行毒株不易在实验室传代培养,对于该病的疫苗研发工作是一个很大的阻碍。本研究旨在通过靶向RNA重组反向操作平台,对影响PEDV在VERO上的细胞适应能力的S基因进行分段替换,最终找到该基因影响细胞适应能力的决定性功能域。本研究分为两个部分。第一部分:将实验室已经构建好的三个携带嵌合S基因的转移载体体外转录成RNA,通过电转,使嵌合的S基因整合进入PEDV病毒基因组,再将重组的PEDV(rPEDV)感染VERO细胞,从而获得能够在VERO细胞上产生CPE并且连续传代的重组PEDV。第一部分中嵌合的S基因分别是:1号,非细胞适应株(即野生型毒株,wild type,简称Wt)的S基因406-4162nt替换细胞适应毒株(即弱毒株,attenuated,简称Att)对应片段;2号,Wt的S基因1598-4162nt替换Att对应片段;3号,Wt的S基因406-1597nt替换Att对应片段。此外,在转移载体中,由R]LUC(海肾荧光素酶,RenillaLuciferase)基因替换了原本的ORF3基因。RLUC能够编码海肾荧光素酶蛋白,该蛋白与特定的底物相互作用后可以发出仪器能够检测的荧光,因此将其作为病毒细胞内增殖的标记基因。整个拯救过程重复三次,其中两次都成功拯救出了 3号重组病毒(Wt-S406-1597nt替换Att对应片段)。通过对拯救出的3号重组病毒部分代次的序列鉴定和RLUC发光值测定,我们发现2个平行实验组的S蛋白分别有一个氛基酸位点发生了突变,同时表现出不同的RLUC活性。通过以上结果,我们推测对于PEDV在VERO上的细胞适应能力,406-1597nt这一区段不起决定性作用。第二部分:构建新的嵌合S基因,连接跟第一部分相同的载体,获得新的转移载体。在第一部分实验结果的基础上,分别替换S基因1-405nt,1598-2820nt,2821-4162nt。三个转移载体分别命名为a,b,c。a为用非细胞适应株(即野生型毒株,wild type,简称Wt)的S基因1-405nt替换细胞适应毒株(即弱毒株,attenuated,简称Att)对应片段构建而成的质粒;b是Wt的S基因2821-4162 nt替换Att对应片段构建而成的质粒;c是用Wt的S基因1598-2820nt替换Att对应片段构建而成的质粒。通过对载体和S基因上的限制性单酶切位点的分析,最终选择位于1a基因9nt的Sma I,S基因405nt的Apa I和4154nt的PmlI。通过PCR分别扩增Wt毒株和Att毒株的小片段,再通过融合PCR,将小片段融合成两段覆盖酶切位点的大片段。将融合得到的大片段连接pJET-Blunt载体进行克隆并且测序。选择测序正确的Blunt载体,用对应的限制性内切酶将目的片段从Blunt载体上切下来。与此同时,用对应的限制性内切酶切开pPEDV载体。将切开的大小正确的条带胶回收纯化后,利用T4连接酶将目的片段和pPEDV载体连接,并且克隆测序,从而获得正确的转移载体。