随着二代测序技术的发展,人们对临床肿瘤病人样本进行测序后鉴定了大量的核苷酸变异,这些变异可以被分为遗传性突变和体细胞的突变,其中一些变异在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用,因此确定核苷酸突变的作用对于癌症风险评估和肿瘤治疗都具有重要的意义。研究中由于缺乏有效的高通量评估方法研究核苷酸变异的功能影响,即便是在已知的肿瘤相关基因内仍然存在大量未知功能的核苷酸变异,这也制约了临床预防治疗的开展。以遗传性乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2为例,这两个基因功能的缺失会大大增加罹患乳腺癌和卵巢癌的概率,已经检测到的大量核苷酸突变,只有一部分变异已知会影响基因正常的功能。目前高通量功能性评估基因内部核苷酸的变异的影响仍然十分困难。为了高通量研究BRCA1/2基因的核苷酸变异的功能,本研究运用以CRISPR-Cas9为基础开发出的碱基编辑工具对内源所有可编辑基因位点进行编辑,通过计算编辑前后变异对细胞生长的影响鉴定致病性突变。我们采用了两种识别NGG PAM序列的碱基编辑工具,分别可产生C到T和A到G的编辑类型,筛选中细胞系选择对BRCA1和BRCA2正常基因功能依赖的完全单倍体细胞系eHAP。因为识别NGGPAM序列的工具可编辑范围有限,为了扩展可编辑的范围,我们开发了两种识别NGPAM序列的编辑工具。根据编辑工具对活性窗口及PAM序列的要求,我们对两基因的外显子区设计向导RNA（sgRNA）,针对BRCA1设计了 4032个sgRNA,针对BRCA2设计了 5298个sgRNA。经过sgRNA引导碱基编辑工具对靶位点进行编辑,通过计算sgRNA造成的变异对细胞生长的影响评估变异的功能。为了排除sgRNA效率差异对功能作用评估产生的干扰作用,我们采用了 sgRNA和靶序列配对的策略评估不同sgRNA的编辑效率,通过报告系统计算sgRNA的编辑效率,将效率代入细胞生长模型探究约9000个变异对细胞生长造成的影响。通过效率矫正模型计算我们鉴定了 919个变异影响基因的功能,其中包括154个位于非翻译区的变异,还有许多变异位于已知重要的结构域,许多都被临床数据库确定为有害突变或未知功能的变异。我们用功能实验验证了部分位于5’非翻译区和可变剪接区的变异以及非同义突变对基因功能的影响,结果表明筛选到的致病性突变对细胞生长会造成影响。本研究通过碱基编辑工具对BRCA1和BRCA2基因的核苷酸变异同时进行高通量的功能性研究,首次运用可识别NG PAM序列的编辑工具研究核苷酸变异的功能。通过将碱基编辑工具的效率代入计算模型矫正变异功能影响的大小,使评估更准确。通过筛选我们确定了许多已知和未知的对功能具有重要影响的变异,尤其鉴定了一批没有报道过的位于非翻译区的变异。本研究说明了碱基编辑工具在高通量探究肿瘤基因核苷酸变异功能影响的可行性,表明了非编码区的变异对基因的功能具有重要的影响。本研究能够快速高效地探究变异对基因功能的影响,有助于回答基因型和表型关联规律这一遗传学问题,对我们理解肿瘤的发生发展机制提供帮助;研究筛选出的一批影响功能的重要位点,也将为癌症风险预测和治疗提供重要信息。