【摘 要】
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种条件致病菌,具有极强的环境适应性和致病性,其致病性受到多重信号的调控,其中最重要的信号调控网络就是群体感应系统（QS系统）。铜绿假单胞菌的QS主要包括Las系统、Rhl系统、喹诺酮信号（PQS）系统。Las系统由las R和las I两部分组成。las R的缺失通常会导致其控制的多种毒性因子发生受损,进而影响铜绿假单胞菌的致病性。本
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种条件致病菌,具有极强的环境适应性和致病性,其致病性受到多重信号的调控,其中最重要的信号调控网络就是群体感应系统（QS系统）。铜绿假单胞菌的QS主要包括Las系统、Rhl系统、喹诺酮信号（PQS）系统。Las系统由las R和las I两部分组成。las R的缺失通常会导致其控制的多种毒性因子发生受损,进而影响铜绿假单胞菌的致病性。本论文通过酵母双杂交技术,在铜绿假单胞菌中寻找与Las R蛋白有相互作用的蛋白,进而研究这些互作蛋白与铜绿假单胞菌毒力的关系,完善Las R的调控网络,本论文的研究结果可以为控制铜绿假单胞菌的感染提供新的思路。本论文首先构建了p GBKT7-las R蛋白诱饵质粒,并进行自激活检测和毒性检测。结果表明诱饵蛋白Las R对酵母菌不存在自激活现象,对酵母细胞没有毒性,该质粒可以用于后续的实验。接下来,我们将p GBKT7-las R蛋白诱饵质粒与铜绿假单胞菌PAO1全基因组文库质粒进行杂交,通过四缺（SD-TLHA）固体平板筛选与lac Z报告基因检测,以筛选与Las R互作的蛋白。通过SD-TLHA固体平板筛选得到184个克隆子,利用lac Z报告基因进行检测,并经过PCR验证去除假阳性之后得到25个阳性克隆。测序与BLAST分析结果表明,25个阳性克隆中包含19个基因的编码序列。将这19个基因的重组质粒（p GADT7-X）分别与p GBKT7-las R质粒共同转化入酵母菌中进行回转验证,得到两个与Las R有相互作用的蛋白:Hut G（N-甲酰谷氨酸酰胺水解酶）和PA5509（组氨酸分解代谢酶）。最后,本论文利用敲除菌株和回补菌株研究了Hut G对铜绿假单胞菌相关毒力表型的影响,结果发现Hut G能够促进绿脓菌素的产生,不影响细菌的运动能力和生物被膜的形成。综上所述,本实验借助酵母双杂交的方法获得了两个与Las R相互作用的蛋白:Hut G和PA5509,同时发现Hut G促进铜绿假单胞菌绿脓菌素的产生,本论文的研究结果为后续研究Las R相互作用的蛋白提供理论依据,以剖析该菌的致病机理,从而提供了治疗铜绿假单胞菌感染疾病的理论依据。
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