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奶牛乳腺炎是由多种病因引起的一类以产奶量及产奶品质下降为主要特征的奶牛常见病,严重威胁畜牧业发展和人类健康。病原菌是引起奶牛乳腺炎最重要的原因,常见的病原菌主要有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等,其中尤以金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎最为常见。近年来,随着抗生素的滥用,金黄色葡萄球菌的耐药菌株不断出现,更增加了这一疾病的防治难度。Gasdmermin D(GSDMD)蛋白是近年来发现的天然免疫防御分子,其前体不具有生物活性。当PRRs识别外源性的PAMP,或内源性的DAMP激活炎性体后,募集接头蛋白ASC和激活Caspase-1,4,5,进而剪切GSDMD产生具有生物活性的N末端GSDMD-N。具有生物活性的GSDMD-N可特异性的识别真核细胞膜内层磷脂酰肌醇磷酸盐(PIPs)、磷脂酸(PA)和磷脂酰丝氨酸(PS)并与之相结合,介导细胞焦亡及炎性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。此外,GSDMD-N还可以特异性的识别细菌的生物膜成分心磷脂并与之相结合,进而形成大量蜂窝状孔道,使细菌崩解死亡。减毒沙门菌菌株SL7207可以携带真核表达质粒,作为载体携带外源基因到宿主细胞中表达。利用乳蛋白特定启动子使外源基因在动物乳腺中高效表达是目前研究的热点。乳腺是一个相对封闭的系统,乳腺表达的蛋白大多不会回流到血液循环,避免高表达的外源蛋白对动物造成的伤害,具有一定的安全性。此外,动物乳腺在表达外源蛋白时会对外源蛋白进行糖基化、脂化、磷酸化等复杂修饰,使其产品更加接近天然蛋白生物活性。基于乳腺表达载体的以上优点,本实验拟借助减毒沙门菌携带外源GSDMD-N基因,在WAP启动子的作用下,使GSDMD-N在乳腺上皮细胞中高效表达,并在体内、体外评价该表达产物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果,以期为防治金黄色葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎奠定理论和实验基础。本实验首先以携带WAP启动子的质粒为模板扩增了大鼠的WAP启动子片段,然后将该启动子连接到无启动子的pEGFP-1载体上(pEGFP-WAP);随后以小鼠的骨髓来源巨噬细胞的cDNA为模板,扩增小鼠的GSDMD-N基因,连接到含有WAP启动子的pEGFP-WAP表达载体上(pEGFP-GSDMD-N-WAP),然后把该重组(pEGFP-GSDMD-N-WAP)质粒电转到SL7207减毒沙门菌上,由此获得了携带GSDMD-N基因、WAP启动子的重组减毒沙门菌。随后利用重组菌侵染牛乳腺上皮细胞借助Western blot检测GSDMD-N在牛乳腺上皮细胞的表达情况,并评价该表达产物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果,同时对重组菌的安全性进行检测。研究表明减毒沙门菌携带的GSDMD-N基因在牛乳腺上皮细胞中高效表达,且该表达产物对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,同时该表达产物对乳腺上皮细胞没有损伤。随后,我们通过金黄色葡萄球菌建立小鼠乳腺炎模型,评价携带GSDMD-N-ORF的重组沙门菌对该乳腺炎的治疗效果。通过H&E染色发现金黄色葡萄球菌能够引起明显的乳腺上皮损伤和大量炎性细胞浸润及其炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的释放,同时携带GSDMD-N端的重组沙门菌能够抑制金黄色葡萄球菌的增殖,而携带空载体的重组菌不能缓解金黄色葡萄球菌所引起的乳腺炎及不能抑制金黄色葡萄球菌的增殖。此外,我们对重组沙门菌的安全性进行评价,通过H&E染色发现携带GSDMD-N-ORF的重组菌注射到乳腺中后对肝脏、肾脏、脾脏及乳腺没有明显的损伤,也不能够诱导乳腺组织产生IL-6、IL-1β、TNF-α炎性细胞因子。综上所述,携带GSDMD-N-ORF的重组沙门菌在体内、外均能较好的抑制金黄色葡萄球菌的增殖,并且具有一定的安全性,可以为奶牛乳腺炎的防控和治疗提供理论基础和科学依据。