研究背景:水体中的有机氮磷增加造成的蓝藻水华会引起水体的严重污染。微囊藻毒素(Microcystins)作为其中含量最多,危害最大的有毒物质之一,受到人们的广泛关注。微囊藻毒素最重要的毒性是肝脏毒性,随着研究的深入,人们发现其也具有强烈的生殖毒性,生殖腺可能是其第二大靶器官,前期研究我们已经发现其通过氧化应激造成雄性生殖毒性,但微囊藻毒素以何种方式引起生殖腺的损伤目前尚未完全阐明。目的:本实验研究MC-LR引起雄性斑马鱼性腺损伤并损害其生殖能力;以及MC-LR引起雄性性腺和TM4支持细胞的内质网应激和自噬的发生,进一步研究发现MC-LR是通过内质网应激诱导自噬的机制造成生殖影响,为阐明MC-LR雄性生殖毒作用机理提供支持,并为防治对策提供理论依据。研究方法:第一部分MC-LR暴露损伤雄性性腺并影响雄性斑马鱼生殖能力3月龄的成年雄鱼360条随机分为对照组、5μg/L MC-LR组、25μg/L MC-LR组,将其饲养在含有相应MC-LR浓度的水中暴露30天,取其中20条鱼进行交配产卵实验,雄鱼与未染毒雌鱼交配产卵,每天收集卵,并计算孵化率,幼鱼的成活率、心率、畸形率。剩下成鱼解剖并收集其性腺组织,每组随机取6条鱼进行组织形态学试验观察性腺受损情况,其余液氮冷冻并转移至-80℃冰箱保存。第二部分MC-LR诱导雄性斑马鱼性腺和小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞)自噬的发生雄性斑马鱼性腺免疫组化观察其自噬情况,LC3B免疫荧光染色观察其自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察其自噬小体、内质网等亚细胞结构的变化。蛋白免疫印迹法检测其自噬相关蛋白ATG5、ATG12、LC3B、LC3A、ULK1表达量的变化,用q RT-PCR检测自噬相关基因ATG5、ATG12、LC3B、ULK1的表达水平。对TM4细胞进行MC-LR暴露,暴露剂量为0、7.5、30μg/ml,时间为24h。随后用荧光染色观察LC3B表达和溶酶体表达变化情况,同时采用蛋白免疫印迹法检测其自噬相关蛋白ATG5、ATG12、LC3B、LC3A的表达水平,用q RT-PCR检测自噬相关基因ATG5、ATG12、LC3B的表达水平。第三部分内质网应激诱导自噬在MC-LR致雄性生殖损伤中的作用将生长状态良好的TM4细胞传代分成7组,分别为对照组、MC-LR组(7.5μg/ml、30μg/ml)、自噬干预组(3-MA)、内质网应激干预组(4-PBA)、30μg/ml MC-LR+干预组(3-MA+30μg/ml MC-LR、4-PBA+30μg/ml MC-LR)。溶酶体免疫荧光染色观察细胞内溶酶体数量的变化。蛋白免疫印迹法检测内质网应激相关蛋白GRP78、自噬相关蛋白LC3A、LC3B以及PERK-e IF2α-ATF4通路相关蛋白p-PERK、PERK、p-e IF2α、e IF2α、ATF4、m TOR、ULK1、ATG5、ATG12表达的变化,q RT-PCR检测内质网应激相关基因GRP78、自噬相关基因LC3B以及PERK-e IF2α-ATF4通路相关基因ATF4表达的变化。结果:第一部分MC-LR暴露损伤雄性性腺并影响雄性斑马鱼生殖能力(1)MC-LR暴露能造成雄性斑马鱼性腺损伤,并影响其生殖能力:免疫组化观察发现在5μg/L组中出现轻微的性腺组织萎缩,生精细胞出现轻微空泡化;25μg/L组中睾丸组织生精小管中生精细胞排列紊乱,组织空泡化程度加重。并且随着剂量的上升,成熟精子数量也明显下降。透射电镜观察斑马鱼睾丸组织发现,25μg/L组中发现自噬小体增多,并且细胞间隙扩大,出现空洞,成熟的精子形态出现异常。(2)交配产卵试验结果显示,随着染毒剂量的提高,子代的孵化率、幼鱼的成活率、心率均明显下降。与对照组相比,5μg/L组幼鱼畸形率无显著差异,但在25μg/L组显著上升。(3)CCK-8结果显示,相较于对照组,30μg/ml组TM4细胞存活率显著下降,而使用自噬抑制剂3-MA干预能显著提高30μg/ml组细胞的存活率。第二部分MC-LR诱导雄性斑马鱼性腺和TM4细胞中自噬的发生。(1)雄性斑马鱼性腺免疫荧光发现,随着暴露剂量的上升,性腺中LC3B表达也随之上升;TM4细胞免疫荧光也呈现类似的结果,30μg/ml组中LC3B表达量和溶酶体的量均显著上升,自噬抑制剂3-MA可以抑制LC3B表达和溶酶体量的上升。(2)斑马鱼性腺蛋白免疫印迹检测发现,自噬相关蛋白ATG5、ULK1、LC3B/LC3A表达量在5μg/L组无明显差异,而在25μg/L组明显上升,ATG12表达量在5μg/L组和25μg/L组均明显上升。q RT-PCR检测自噬相关基因ATG3、ATG5、LC3B、ULK1,发现ATG3、ATG5表达随着剂量的上升而上升,LC3B、ULK1在5μg/L组表达变化不明显但在25μg/L组表达明显上升。(3)TM4细胞免疫印迹实验表明自噬相关蛋白ATG5和ATG12的表达量随着剂量的上升而上升,与对照组相比,LC3B/LC3A比值在7.5μg/ml组无明显变化,而在30μg/ml组上升明显。使用q RT-PCR检测其自噬相关基因ATG5、ATG12、LC3B的水平,结果与蛋白的表达类似,随着染毒剂量的提高,其表达水平呈上升趋势。自噬抑制剂3-MA共处理发现自噬相关蛋白ATG5、ATG12、LC3A/LC3B的表达被所抑制。第三部分内质网应激诱导自噬在MC-LR致雄性生殖损伤中的作用TM4细胞的蛋白免疫印迹和q RT-PCR均观察到,内质网应激标志物GRP78的表达随着MC-LR暴露剂量的上升而上升。内质网应激PERK-e IF2α-ATF4通路相关蛋白表达也会受到影响。随着MC-LR染毒浓度的上升,p-e IF2α/e IF2α、ATF4表达量也随之上升,p-PERK/PERK、ULK1在30μg/ml组表达显著上升。当使用内质网应激抑制剂4-PBA抑制内质网应激后,与30μg/ml组相比,p-e IF2α/e IF2α、p-PERK/PERK、ATF4、m TOR表达量均明显下降,ULK1表达无显著变化,q RT-PCR检测ATF4基因表达水平显著降低。同时我们还发现4-PBA共处理自噬相关蛋白ATG5、ATG12、LC3A/LC3B的表达被抑制。q RT-PCR检测ATG5、ATG12、LC3B基因表达也被抑制,其结果与蛋白表达结果相一致。同时,免疫荧光也观察到细胞内MC-LR所诱导的溶酶体含量的上升也被4-PBA所抑制。结论:雄性斑马鱼暴露于MC-LR会导致其性腺组织受损,进而引起生殖能力的损害,研究还发现性腺组织中内质网应激和自噬的发生。为了探究MC-LR引起的内质网应激和自噬的关系,进一步使用TM4细胞进行试验,结果发现抑制内质网应激会导致自噬的抑制,而且会导致PERK-e IF2α-ATF4通路相关蛋白和基因表达的抑制,因此猜测MC-LR可能是通过内质网应激PERK-e IF2α-ATF4通路诱导自噬的发生,从而引起生殖损伤。