烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT)，又名内脏脂肪素(visfatin)，是一种由脂肪细胞分泌的细胞因子。NAMPT能够催化生成烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN），NMN继而被烟酰胺单核苷酸腺嘌呤转移酶（Nicotinamide momonucleotide adenylyltransferase，Nmnat）转化为NAD+。NAMPT是NAD+合成第一步的限速酶。内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，在胚胎或者成年机体缺血、创伤等病理状态下参与血管的生成，与缺血部位新生血管形成、重塑密切相关。国内外众多实验结果和临床证据表明，内皮祖细胞在缺血后血管新生的过程中发挥了极其重要的作用，循环系统中的内皮祖细胞数量可以预测心脑血管事件和糖尿病的发生[1-3]。注入外源内皮祖细胞可增加缺血心肌的血管新生，改善心肌梗死后的心室功能[4-5]。内皮祖细胞移植的开展为促进缺血性疾病局部血管新生、改善缺氧提供了新的手段，一经出现就受到了医学界的广泛关注，成为治疗严重缺血性疾病的手段之一，但移植后的内皮祖细胞靶向性较差导致内皮祖细胞利用率的低下，限制了内皮祖细胞的广泛应用。因此，发现内皮祖细胞在体内趋化的途径，增加内皮祖细胞在体内的归巢已成为目前研究的热点。然而，大量的研究证据也揭示了，在内皮祖细胞介导的血管新生和伤口愈合的过程中，还有其他内源性调节因子的参与[6-7]。众所周知， NAD+是生命体内200多种氧化还原反应的辅酶，是电子传递链和能量代谢过程中非常重要的一个辅因子，参与能量传递过程中的众多信号转导通路[8]。在细胞的很多生理过程中如Ca2+动员、基因稳定、凋亡、代谢、应激、老化等起着至关重要的作用。NAMPT是哺乳动物NAD+合成途径的限速酶，调节着细胞内总的NAD+水平和线粒体中的NAD+水平。大量研究表明，细胞内外均存在的NAMPT，在调节细胞存活、免疫应答、昼夜节律和代谢异常的过程中起到了关键作用[9-13]。此外，我们实验室在之前的工作中已经证实NAMPT在脑卒中中具有神经元保护作用。因此，我们推测NAMPT可能与缺血后内皮祖细胞的功能发挥有关。为此，我们设计了本论文中的一系列实验来验证这一设想。在整体动物水平，我们分别利用NAMPT的化学抑制剂FK866，以及过表达NAMPT的转基因动物，研究干预NAMPT对内皮祖细胞功能的影响。首先，我们通过对普通C57BL/6J小鼠实施右下肢股动脉结扎手术，造成下肢缺血模型，再腹腔注射FK866（NAMPT酶特异性抑制剂）数天，与手术组和假手术组相比，以骨髓中和外周血中内皮祖细胞的数量作为检测指标，验证NAMPT对内皮祖细胞的生成和其向外周血中的动员有无影响，并对结果进行统计分析。转基因动物我们采用了NAMPT过表达小鼠和NAMPT酶突变体过表达小鼠，通过对转基因小鼠实施右下肢股动脉结扎手术，造成下肢缺血模型，与野生型小鼠手术组相比，以骨髓中和外周血中内皮祖细胞的数量，缺血下肢血流量作为检测指标，验证NAMPT对内皮祖细胞的生成和其向外周血中的动员有无影响，并对结果进行统计分析。在细胞水平，我们利用免疫磁珠分选细胞的方法，从小鼠骨髓细胞中分离得到了内皮祖细胞，并加以体外培养，用FK866（NAMPT酶特异性抑制剂）孵育培养的内皮祖细胞，观察其增殖、分化、迁移能力及成管型性。此外，我们也采用同样的内皮祖细胞提取方法提取了NAMPT过表达小鼠和NAMPT酶突变体过表达小鼠骨髓中的内皮祖细胞，加以体外培养，观察并比较这两种内皮祖细胞增殖、分化、迁移能力和成管型性，研究NAMPT对内皮祖细胞增殖、分化、迁移和成管性等生物学功能的影响。动物实验结果显示，用FK866抑制NAMPT活性后，由于缺血引发的内皮祖细胞在骨髓中的生成和向外周血中的动员被抑制了。此外，转基因小鼠部分的实验结果显示，与野生型小鼠相比，NAMPT过表达小鼠血液和骨髓中的内皮祖细胞数量显著增加，而NAMPT酶突变体小鼠与野生型小鼠血液和骨髓中的内皮祖细胞数量基本接近，这些现象说明过表达NAMPT能够促进内皮祖细胞在骨髓中的生成和向外周血的动员。在细胞实验中我们也发现，用FK866抑制NAD+后，降低了内皮祖细胞的增殖、动员，破坏了内皮祖细胞的成管。而NAMPT过表达内皮祖细胞的增殖和迁移能力增强，小管形成增多。在NAMPT酶突变体过表达内皮祖细胞中，则没有观察到这些现象。本课题首次就NAMPT对内皮祖细胞功能的调节作用进行了研究，通过整体动物部分实验和细胞水平实验，互为佐证，探索NAMPT在内皮祖细胞功能发挥中所起的作用。所有这些结果表明NAD+，和NAD+合成的限速酶NAMPT，是缺血后内皮祖细胞调节的血管新生过程中所必需的。