糖基转移酶(GTs)是自然界广为存在的一大类酶,在动物、植物、细菌和病毒中都有发现,催化活化糖供体(通常是尿苷二磷酸-糖,UDP-糖)的糖基转移到受体分子(苷元)上,完成糖基化反应。糖基化反应改变了苷元的性质,如生物活性、溶解性和在细胞间转运的特性,在生物体内行使多种功能。糖供体包括UDP-葡萄糖醛酸(UDP-glucuronic acid)、UDP-葡萄糖(UDP-glucose)、UDP-半乳糖(UDP-galactose)、UDP-木糖(UDP-xylose)等,而受体分子包括各种内源和外源化合物。哺乳动物尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)利用UDP-葡萄糖醛酸作为糖供体,催化许多内源底物如胆汁酸、类固醇等化合物的糖基化,参与其在体内的代谢和平衡调节。此外还催化外源化合物如致癌物、有毒物质和治疗用药物的糖基化反应,参与解毒反应和药物清除。植物中的UGTs主要以UDP-葡萄糖作为糖供体,催化内源底物包括植物激素和二级代谢产物的糖基化,在调节植物生长、帮助植物抵御环境压力等生理过程中起重要作用,此外还参与除莠剂等异生物质的解毒过程。哺乳动物特别是人类的UGTs,由于参与致癌物解毒和治疗用药物的代谢清除,在制药和临床研究上的潜在价值引起广泛关注而得到了深入的研究,植物中关于UGTs的研究报道也较多,而昆虫中则相对较少。现有的研究表明昆虫中的UGTs与相关的哺乳动物和植物中的这类酶有着许多相似的特征,在昆虫中起着同等重要的作用。家蚕已发展成为研究鳞翅目昆虫的重要模式生物,其体内有多个UGTs,研究家蚕的UGTs基因具有重要意义——不仅可以阐明其在家蚕生长发育过程中担负的功能,同时也可为其它昆虫UGTs基因的研究提供重要的分子依据。本文克隆了家蚕中的一个尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因BmUGT4965,分析了其序列特征,检测了在家蚕幼虫5龄第3天各组织中的表达情况,真核表达了该基因,并检测了其对供试底物的催化活性。获得的主要结果如下1 BmUGT4965基因的克隆和序列分析克隆了BmUGT4965基因(NCBI登录号EU873318),该基因定位于第25染色体上,完整编码区序列长度为1578bp,由4个外显子和3个内含子组成,且所有的外显子／内含子拼接边界均符合典型的GT-AG规则。BmUGT4965基因编码的蛋白含有UDPGT典型结构域,分为N-末端和C-末端两个结构域。与其它序列的比对表明其C端部分氨基酸序列比较保守,而负责结合结构多样的苷元的N端部分保守性较低。与哺乳动物UGTs一样,BmUGT4965蛋白定位于内质网中,是膜结合蛋白。其N端含有信号肽,紧接着是一段非常保守的序列,哺乳动物UGTs该区域可能参与寡聚体形成,另外N端还有一个N-糖基化位点。这些表明其天然形式可能是个寡聚体,而且是糖蛋白。该蛋白C端区域含有一个跨膜区,紧接着是一段富含碱性氨基酸的序列,这两段区域共同作用将其锚定在内置网膜上,而N段区域伸入内质网腔。2 Bm UGT4965基因的组织表达分析应用RT-PCR技术检测BmUGT4965基因在家蚕幼虫5龄第3天的中肠、血液、丝腺、体壁、头、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢共9个组织中的表达情况,结果表明其在丝腺和脂肪体中表达量较高,在中肠和马氏管中有微弱表达。表达的组织特异性较高。3 BmUGT4965基因的真核表达构建重组表达载体,利用Bac to Bac杆状病毒表达系统在Hi-5细胞中表达融合的目的蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting检测,表达得到了约为64.5kDa的目的蛋白。4 BmUGT4965蛋白活性检测以槲皮素和山奈酚作为底物,检测重组表达蛋白的粗酶催化活性,结果表明外源表达的BmUGT4965蛋白能够催化这两种底物,分别生成两种和一种产物。桑叶中黄酮类化合物被家蚕中肠吸收后先在其5-O位置经一步糖基化,其产物经血液进入丝腺和脂肪体中后,在4’-O位置再一次被糖基化修饰。BmUGT4965蛋白可能参与了后面这一步代谢,从而促成蚕茧中的黄酮类化合物行使其抗氧化功能。