论文部分内容阅读
猪链球菌2型是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，是一种重要的人畜共患致病菌。本研究根据猪链球菌2型毒力因子EF和MRP的已知序列设计引物，通过PCR扩增出EF和MRP的基因片段，然后将扩增产物分别克隆入pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T-EF和pMD18-T-MRP。然后通过亚克隆方法分别从重组质粒pMD18-T-EF和pMD18-T-MRP中扩增出包含EF蛋白和MRP蛋白主要抗原位点编码区(EF:2236-2397bp，MRP:1026-1181bp)的目的片段。接着，利用重组PCR技术将上述含有EF和MRP主要抗原位点的基因片段(2236bp-2397bp)和(1026bp-118 lbp)用linker连结起来构成了一个含363bp重组片段。将该重组片段定向克隆到原核表达载体pET-32a中，构建了pET-32a-EF-MRP的表达载体；经过测序正确后，将重组表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中；用lmmol/L IPTG诱导后pET-32a-EF-MRP出现32.5KD大小的目的融合蛋白，蛋白主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。经Western-blotting鉴定表明，融合蛋白能够被猪链球菌2型阳性血清所识别。用Ni2+亲和层析柱对融合蛋白进行纯化，获得3.58 mg/L的His-EF-MRP目的蛋白。利用纯化的重组蛋白His-EF-MRP作为包被抗原，建立了检测锗链球菌2型抗体的间接ELISA方法，并且对间接ELISA方法反应参数和反应条件进行摸索。结果表明重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.5ug/mL;最适包被条件是37℃过夜，以1％BSA作为封闭液；二抗HRP-羊抗猪IgG最佳工作浓度为1:2000;高免血清最大稀释度为1：400;待检血清的最佳稀释度为1:40;底物最适作用时间为37℃作用15 min:阴阳性临界值为0.36。特异性试验表明，建立的间接ELISA方法不均与其他细菌和病毒的阳性血清发生交叉反应。敏感性试验表明，间接ELISA方法比AGID检测敏感32-128倍。稳定性实验表明，血清的批内变异系数为0.11％-5.92％，批间变异系数为4.15％-8.17％，建立的间接ELISA方法具有很高的重复性。研究结果表明建立的间接ELISA方法可以用于猪链球菌2型血清抗体的检测。