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一、研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种隐匿性起病、缓慢进展、最为常见的中枢神经系统退行性病变,其病理特征主要有神经细胞内的神经原纤维缠结(Neurofibrillary Tangle, NFT)、神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-Amyloid Protein, Aβ)聚集形成的老年斑、血管淀粉样病变、选择性神经元丢失、突触损伤等。AD的病因和发病机制尚未完全明确,目前,Aβ级联学说占据众多病因学说中的主流地位。为防止Aβ在脑内滞留、发生错误蛋白折叠,产生神经毒性作用或纤维化变性沉积形成老年斑,保持Aβ的产生和清除处于动态平衡是其关键。对AD治疗策略的研究逐渐形成“早发现、早干预,保持脑环境Aβ正常水平”的思路。在阿尔茨海默病早期的脑组织中,Aβ主要为可溶性,其中一部分存在于脑细胞中,而大部分是存在于组织间液(Interstitial Fluid, ISF)之中。鉴于血-脑脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)屏障的存在,脑室CSF的目标溶质浓度也可以作为测量大脑ISF释放水平的间接指标,然而对脑内代谢环境进行观察时ISF是优于CSF的更为直观的选择。组织微量透析法是测量脑ISF中所含溶质最直接的采样方法,并且因为它可以结合使用各种定量分析技术的优势,该法已经被高效地应用于检测各种不同溶质分子,在神经退化性疾病的ISF所含溶质水平变化趋势的研究中的应用经验已十分丰富。二、实验目的本实验拟在前期实验证明针刺可降低APP/PS1双转基因小鼠脑组织Aβ水平的成果基础上,运用脑部微量透析方法采集脑组织间液,观察APP/PS1小鼠脑间质液中可溶性A β1-42的含量在选择“百会”、“涌泉”配穴的短疗程电针刺激下是否发生变化,解释电针改善脑组织淀粉样沉积病变的可能作用途径。结合检测海马组织中A β1-42经血脑屏障转运途径关键受体LRP-1的表达水平,并分析电针对其产生的可能影响,探索针刺二穴治疗阿尔兹海默病的可能机制。三、实验方法4月龄雄性APPswe/PSlDE9双转基因小鼠20只,称重排序后按随机数字表法分为模型组和针刺组,每组各10只。同月龄同性别同背景APPswe/PS1DE9双转基因阴性(野生型)小鼠10只,设为正常对照组。将针刺组小鼠以自制鼠袋固定于操作台上,按照大鼠针灸穴位图谱及比较解剖学方法,在顶骨正中取“百会”,在两足底前、中1/3交界处取“涌泉”。选用医用针灸针(规格0.25 mm×13mm),穴位与针具常规消毒,斜15。角刺入穴位皮下2-3mm,“百会穴”手针,双“涌泉穴”小幅度捻转后接HANs电针仪,采用疏密波,频率为1/50Hz,强度0.5mA,以针柄震颤,动物保持安静不挣扎嘶叫为度。每次针刺持续15min,每日1次,治疗3次。模型组及正常对照组的小鼠以相同方法用鼠袋束缚15min,每日1次,束缚3次。治疗结束后,每组选择8只小鼠,进行腹腔注射麻醉后,手术将微透析探针埋入小鼠左侧海马,观察小鼠生命情况良好,将其送入CMA/120清醒动物活动装置,该装置可保证小型实验动物在其清醒状态下进行长时间的微透析研究工作。将探针与CMA微量取样系统相连接,进行内外压平衡1小时。以0.5 μ1/min的灌流速度进行微透析,灌流液选择不含蛋白的人工脑脊液,一次取样透析时间为1小时,每只小鼠取4次透析液样品,分别是最后一次干预结束后第6、7、8、9小时的脑间质液样品。用人Aβ1-42Elisa超敏试剂盒(96T,美国life technologies公司,KHB3544)检测脑间质液可溶性A β1-42的含量,并根据样品稀释浓度及探针回收率计算出小鼠海马脑间质液中A β 1-42浓度。分析组间比较结果以及针刺后随时间变化结果。微透析采样结束后,取小鼠左侧新鲜海马组织,用western bloting法检测海马组织LRP-1蛋白表达量,观察其是否发生变化,若存在组间差异则分析实验干预手段与LRP-1变化的相关性。另外每组各2只小鼠,治疗结束后,麻醉小鼠,行心脏灌注固定后取脑,石蜡包埋。对脑组织切片后行免疫组化染色,观察海马组织是否存在淀粉样沉积病变以及老年斑的形成状况。四、实验结果1.脑间质液Aβ1-42水平检测：模型组与正常对照组相比,脑组织间液可溶性A β1-42水平升高,且差异有统计学意义(P<0.01)；针刺组与模型组相比,脑组织间液可溶性Aβ 1-42水平降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。提示电针可能对小鼠脑组织间液A β1-42水平起到良性干预(降低)作用。2.针刺后小鼠脑间质液Aβ1-42水平随时间变化：同一小鼠最后一次针刺干预结束后第6、7、8、9小时的脑间质液样品中可溶性Aβ1-42浓度差异无统计学意义,因此可以认为小鼠的短期电针干预结束后第6、7、8、9小时脑组织间液可溶性A β1-42水平处于平衡、非波动状态。3.海马组织Aβ1-42水平检测：模型组与正常对照组相比,海马组织A β1-42水平升高,且差异有显著统计学意义(P<0.01)；针刺组与模型组相比,海马组织可溶性Aβ 42水平降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。提示电针对小鼠脑组织间液A β 42水平的降低调节作用要先于对组织总体Aβ水平的影响。同时提示,电针干预降低脑组织Aβ水平可能是长期促进脑间质液Aβ清除作用的结果。4.海马组织LRP-1表达水平：短期针刺或束缚干预后：三组间LRP-1表达差异无统计学意义(P>0.05)。5.海马免疫组织化学：在血管壁周围未见到淀粉样沉积改变,组织部分未观察到淀粉样斑块形成。五、实验结论1.电针刺激结束后第6-9小时内,AD模型小鼠脑间质液可溶性A β1-42处于稳定水平。2.短疗程电针“涌泉”、“百会”穴,可降低4月龄APP/PS1小鼠海马区脑组织间液可溶性A β 42水平,并且此改变发生于长期针刺影响海马组织总体Aβ水平降低之前。同时,Aβ清除相关蛋白LRP-1在海马组织的总体表达情况不受短疗程电针干预影响。